专利名称：内切壳聚糖酶载体的制备方法和内切壳聚糖酶的固定方法
技术领域：
本发明涉及酶载体的制备方法和酶的固定方法，特别是内切壳聚糖酶载体的制备方法和 内切壳聚糖酶的固定方法。
背景技术：
壳聚糖需要溶解在溶液中后，再经过壳聚糖酶的处理得到小分子的壳寡糖，壳寡糖因分 子量小和其他优良性质被广泛应用于医药和食品等行业。传统的从壳聚糖出发制备壳寡糖的 过程中，通常采用液体状态的酶技术，液体状态的酶的效率虽然能满足生产要求，但有下列 弊端酶的稳定性较差。因为酶是具有一定空间构象的蛋白质，在受到热、pH值、无机离子、 有机溶剂等外界因素的影响下，容易变性失活，反应完毕后的壳聚糖酶和壳寡糖产物都依然 存在液体体系中，二者分离困难，给进一步分离纯化带来了一定的困难。特别是壳寡糖产物 需要灭酶活再做成固体产品，这样一来液体酶也被灭活，因而壳聚糖酶只使用了一次。
内切壳聚糖酶，简称eCSN酶在工业上可用于壳寡糖(Chitooligosaccharides)的生产， 由于壳寡糖有较好的水溶性，更利于人体吸收，特别是聚合度在5、 6的壳寡糖更是具有较强 的抗感染、抑制肿瘤的活性。但是利用化学合成方法生产壳寡糖，尤其是具有较强生理活性 的寡五糖和六糖，非常困难，产率低、生产成本较高且易污染环境，而使用内切壳聚糖酶通 过降解生产壳寡糖却有着高效、环保等优点，因此利用内切壳聚糖酶生产壳寡糖已经成为目 前研究应用的热点。从湖泊淤泥中采集、诱变并分离得到的菌种可产生胞外分泌型內切壳聚 糖酶，对其发酵后的粗酶液进行分离纯化，可获得一种较高活性、专一性的内切壳聚糖酶 (endo-Chitosanase， eCSN)纯品。由于eCSN酶的化学本质是蛋白质，游离酶在使用过程中稳 定性较差，且酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，给产物的分离纯化带来了一定的困 难，酶也不能重复使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种内切壳聚糖酶载体的制备方法和内切壳聚糖酶的固定方法。 本发明的技术方案为
内切壳聚糖酶载体的制备方法，其中经过NaOH、冰乙酸、对甲苯磺酰氯、吡啶处理得
到棉质的纤维条可以作为内切壳聚糖酶载体。
内切壳聚糖酶载体的制备方法，其中棉质的纤维条浸入200ml质量百分浓度为15M的NaOH 溶液中处理10min后，用蒸馏水洗涤数次，再在质量百分浓度为l(^的冰乙酸中浸泡30min，最后用去离子水洗至中性；按15ml吡啶/g棉质的纤维条的比例加入吡啶，在25X:， 250r/min恒 温水浴振荡器中作用0.5h;按15g对甲苯磺酰氯/g棉质的纤维条的比例，向吡啶处理过的棉质 的纤维条中加入用丙酮溶解的对甲苯磺酰氯，每lg对甲苯磺酰氯采用2ml丙酮溶解；在25'C， 250r/min恒温水浴振荡器中作用4h，再加丙酮清洗，再用O. 05mol/L HC1清洗，HC1可以洗去 多余的对甲苯磺酰氯及吡啶，取出的棉质的纤维条可以作为内切壳聚糖酶载体。该载体放于 0. 05mol/L的HCl中4。C保存。
本发明涉及的棉质的纤维条，可以是医药企业生产的医用棉质的纤维条。也可以是其他 的纤维条。
内切壳聚糖酶的固定方法，其中去离子水洗涤载体3次，以250 U /g载体比例，将O. 2mol/L PH5. 5 NatyU—Na2HP04缓冲液稀释的内切壳聚糖酶加入载体中，于250r/min的恒温水浴振荡 器中固定12h，去离子水洗涤，固定化酶4t)缓冲液中保存。
本发明涉及的"U"是酶活力的单位。
游离酶活力测定取100叱1%壳聚糖醋酸溶液，加入内切壳聚糖酶(溶于95化水中)， 在45°C 300r/niin回转式水浴恒温振荡器(SHZ-88型)内连续振荡10min。降解反应结束后， 参照3， 5-二硝基水杨酸法(DNS)比色定糖法测定还原糖量，计算游离酶的活力。
固定化酶活测定取2(KHxL 1%壳聚糖醋酸溶液，加入本发明方法固定化的内切壳聚糖酶 O.Olg，在45。C 300r/min回转式水浴恒温振荡器(SHZ-88型)内反应10min。降解反应结束后， 取100HL还原糖参照3, 5-二硝基水杨酸法(DNS)比色定糖法测定还原糖浓度，计算固定化酶 活力。
l个酶活单位定义1个酶活力(U)单位定义在(45±1) 'C、 pH值为7.0条件下， 一分钟水 解壳聚糖所释放出相当于llimol还原糖所需要的酶量。3,5-二硝基水杨酸法(DNS)比色定糖 法测定还原糖含量。
固定化壳聚糖酶活力回收率=棉质的纤维条上所固定的酶活力(U)/固定前最初加入的酶
活力00
单位固定化酶活(U/g):每克干基棉质的纤维条上所固定的酶活力。 壳聚糖水解率的计算壳聚糖水解率(％)=还原糖含量/起始壳聚糖含量100% 固定化内切壳聚糖酶酶学性质研究 固定化壳聚糖酶最适反应温度
纯化的酶液经固定后，在PH5.5, 0.2mol/LNaH2P04—Na2HP04缓冲液中，分别在30'C、 40°C、 45°C、 5CTC、 55°C、 6(TC下，测定固定化酶活力，以最高酶活力为100%计，该酶经固定化后， 最适反应温度仍为45。C。固定化壳聚糖酶最适反应PH:
纯化的酶液经固定后，分别在(PH4.5-6.5) 0.2mol/L船仏？04—化2^04缓冲液中，45°C 测定固定化酶活力。实验测得游离酶反应最适PH为6.5。酶经固定化后，最适反应PH向酸性方 向偏移l个单位。因此，壳聚糖酶固定化之后，可以用于处理中性偏酸性物质。
固定化eCSN酶的储存稳定性
游离酶及固定化内切壳聚糖酶分别置于0. 2mol/L NaH2P04 —化^04缓冲溶液(pH 6. 5)中， 在4'C下储存，30天后在酶的最适水解条件下测定储存后酶的残余活力。结果表明，储存30 天后固定化内切壳聚糖酶保持较高的酶活力。
固定化eCSN酶的操作稳定性
操作稳定性是衡量固定化酶实用价值的主要指标，以固定化酶的重复水解实验表征其操 作稳定性。将固定化酶湿法装柱，床层加入1%壳聚糖溶液，以每24hr为一个酶水解过程。 一次水解反应完成后，用去离子水洗漆固定化酶，除去固定化酶上残余的降解底物及降解产 物。然后重新进行水解反应，在酶的最适水解条件下参照DNS比色定糖法测定还原糖浓度， 计算固定化酶的剩余活力。结果表明，固定化酶重复水解壳聚糖10次后，酶活仍保持40%。
填充床反应器固定化内切壳聚糖酶酶解壳聚糖
在PH为5.5, 45°C， 20 ml， 1%的壳聚糖溶液与固定化酶连续循环反应，不同时间间隔(6h、 12h、 18h、 24h)取样，通过薄层色谱或HPLC检测酶解液成分中壳寡糖的变化。
内切壳聚糖酶eCSN是水解壳聚糖制备低分子量壳聚糖和壳寡糖的有效商品酶制剂。在本 研究中，将内切壳聚糖酶固定于对甲苯磺酰氯活化的棉纤维载体上，得出制备固定化eCSN酶 的最适条件是pH6.5，离子浓度为0.2mol/L NaH2P04—化2^04缓冲液，加酶量为250U/g载 体，固定化反应时间为12hr，活力回收率可达到60%。固定化酶的最适反应温度没有改变，最 适反应PH向酸性方向偏移1个单位，固定化酶的储存稳定性和操作稳定性表明，应用固定化 内切壳聚糖酶可以连续降解壳聚糖制备低分子量壳聚糖和壳寡糖。
采用本发明的技术方案有下列优点
固化酶便于与反应后的液体体系中的产物分离，而且固化酶取出后可反复使用。与游离 酶相比，酶固定化后，极易与底物、产物分开，可以在较长时间内进行装柱连续反应，产物 壳寡糖溶液中没有酶的残留，提高了壳寡糖的质量；酶有较高的稳定性、较长的操作寿命和 保存期，且酶可重复使用，成本显著降低。本发明以NaOH和吡啶为引发剂，对甲苯磺酰氯作 为中间物，与棉质的纤维条表面的羟基发生反应形成共价键，内切壳聚糖酶在固定过程中， 氨基酸残基上游离的氨基水端通过取代对甲苯磺酰基而共价连接在棉质的纤维条上；研究了固定化酶的酶学性质；并且在填充床柱反应器中探讨了固定化酶连续降解壳聚糖的操作条件，
这对固定化酶的实际生产应用具有比较高的参考价值。
具体实施例方式
实施例l、内切壳聚糖酶载体的制备方法，其中棉质的纤维条浸入200ml质量百分浓度 为15M的NaOH溶液中处理10min后，用蒸馏水洗涤数次，再在质量百分浓度为10%的冰乙酸中浸 泡30min,最后用去离子水洗至中性；按15ml吡啶/g棉质的纤维条的比例加入吡啶，在25。C， 250r/min恒温水浴振荡器中作用0.5h;按15g对甲苯磺酰氯/g棉质的纤维条的比例，向吡啶 处理过的棉质的纤维条中加入用丙酮溶解的对甲苯磺酰氯，每lg对甲苯磺酰氯采用2ml丙酮溶 解；在25'C， 250r/min恒温水浴振荡器中作用4h，再加丙酮清洗，再用O. 05mol/L HC1清洗， HC1可以洗去多余的对甲苯磺酰氯及吡啶，取出的棉质的纤维条可以作为内切壳聚糖酶载体。 该载体放于O. 05mol/L的HCl中4'C保存。
本发明涉及的棉质的纤维条，可以是医药企业生产的医用棉质的纤维条。也可以是其他 的纤维条。
实施例2、内切壳聚糖酶的固定方法，其中去离子水洗涤载体3次，以250U/g载体比例， 将O. 2mol/L PH6. 5 %}^04—化2^04缓冲液稀释的内切壳聚糖酶加入载体中，于250r/min的恒 温水浴振荡器中固定12h，去离子水洗涤，固定化酶4'C缓冲液中保存。其中的载体通过实施 例1方法获得。
权利要求
1、内切壳聚糖酶载体的制备方法，其特征在于经过NaOH、冰乙酸、对甲苯磺酰氯、吡啶处理得到棉质的纤维条可以作为内切壳聚糖酶载体。
2、 内切壳聚糖酶载体的制备方法，其特征在于棉质的纤维条浸入200ml质量百分浓度 为15M的NaOH溶液中处理10min后，用蒸馏水洗涤数次，再在质量百分浓度为10%的冰乙酸中浸 泡30min，最后用去离子水洗至中性；按15ml吡啶/g棉质的纤维条的比例加入吡啶，在25'C， 250r/min恒温水浴振荡器中作用0.5h;按15g对甲苯磺酰氯/g棉质的纤维条的比例，向吡啶 处理过的棉质的纤维条中加入用丙酮溶解的对甲苯磺酰氯，每lg对甲苯磺酰氯采用2ml丙酮溶 解；在25。C， 250r/min恒温水浴振荡器中作用4h，再加丙酮清洗，再用O. 05mol/L HC1清洗， 取出的棉质的纤维条可以作为内切壳聚糖酶载体。
3、 如权利要求2所述的内切壳聚糖酶载体的制备方法得到的内切壳聚糖酶载体的制备方 法应用于内切壳聚糖酶的固定方法，其特征在于:'去离子水洗涤载体3次，以250U/g载体比例， 将O. 2mol/L PH6. 5 NaH2P04—Na2HP04缓冲液稀释的内切壳聚糖酶加入载体中，于250r/min的恒 温水浴振荡器中固定12h，去离子水洗涤，固定化酶4'C缓冲液中保存。
全文摘要
本发明涉及内切壳聚糖酶载体的制备方法和内切壳聚糖酶的固定方法。经过NaOH、冰乙酸、对甲苯磺酰氯、吡啶处理得到棉质的纤维条可以作为内切壳聚糖酶载体。采用本发明的技术方案有下列优点固化酶便于与反应后的液体体系中的产物分离，而且固化酶取出后可反复使用。与游离酶相比，酶固定化后，极易与底物、产物分开，可以在较长时间内进行装柱连续反应，产物壳寡糖溶液中没有酶的残留，提高了壳寡糖的质量；酶有较高的稳定性、较长的操作寿命和保存期，且酶可重复使用，成本显著降低。
文档编号C12N11/12GK101508985SQ20091011511
公开日2009年8月19日 申请日期2009年3月27日 优先权日2009年3月27日
发明者王曼莹, 王超莉 申请人:江西师范大学