专利名称：一种琼脂糖酶的固定化方法
技术领域：
本发明所属酶工程研究开发技术领域。本发明涉及壳聚糖微球固定化琼脂糖酶的方法研究,适合工业化生产。
背景技术：
琼胶是一种重要的海藻多糖，主要由琼胶糖和硫琼胶组成。琼胶酶降解琼胶糖，根据其作用方式不同，可以把琼胶酶分为两类:α -琼胶酶和β -琼胶酶。α -琼胶酶裂解琼月父糖的α _1，3_糖苷键,生成以β-D-半乳糖为非还原性末端和以3,6_内醚-a-L-半乳糖为还原性末端的琼寡糖列；β -琼胶酶裂解琼胶糖的β -1，4-糖苷键，生成以β -D-半乳糖为还原性末端和以3，6-内醚-a -L-半乳糖为非还原性末端的新琼寡糖系列。琼胶酶降解过程具有得率高、污染小和产物的安全性高等优点，是降解琼胶糖最有潜力的方法。琼胶酶降解琼胶糖生产琼寡糖产品已广泛应用于食品业，化妆品业和医药工业，例如作为天然的防腐剂、淀粉老化抑制剂、功能性食品基料、抗氧化剂等。同时琼胶酶在海藻的单细胞分离、酶解破壁制备原生质体等过程具有重要的使用价值，是一种海藻遗传工程的工具酶；在分子生物学方面，利用琼胶酶降解琼胶糖从琼胶糖凝胶中回收DNA和RNA，已经被证明是最好的方法之一；琼胶酶也用于海藻多糖的结构研究，用琼胶酶水解某些海藻的多糖，测定其水解产物的结构，进而推测多糖的结构，是行之有效的方法。但目前该酶的应用研究主要是对游离酶，但游离酶稳定性差，保质期短，重复利用率低，往往使应用成本增高而限制了其应用。所以在酶的应用研究中，固定化酶的研究是生物技术领域中新兴的一门技术。酶的固定化是指用载体材料将酶限制于一定空间内进行催化反应，固定化酶可回收及反复连续利用的一类技术。固定化 酶保留了游离酶高效专一、温和的催化性质，同时又克服了游离酶的缺点，具有高稳定性、易分离纯化、回收使用、操作简便等优点。然而，广泛投入工业化应用的固定化酶却不多。因此，进一步开发更经济适用的固定化方法，使更多的酶取得工业上的广泛应用，仍是科技工作者追求的目标。酶的固定化方法常用的是:吸附法、交联法、共价结合和法包埋法。在此基础上还出现了上述方法的结合法等酶固定化研究中，良好的载体是固定化酶成功的关键。所以在酶固定化领域，作为固定化载体的筛选和制备就成为了主要研究方向。甲壳素是由乙酰胺基葡萄糖以β_1，4链连接而成的天然线性高聚物，是自然界中仅次于纤维素的第二可再生资源。壳聚糖是甲壳素经脱乙酰化反应得到的产物，分子结构中含有丰富的游离氨基。选择壳聚糖作为固定化载体是基于它来源丰富，具亲水性，生物相容性以及抗微生物分解特性等。壳聚糖氨基与戊二醛基形成schifT碱，在胶囊表面形成一层致密的保护膜，可增加微胶囊球的强度，这就是吸附-交联法固定化酶。由于目前琼脂糖酶的固定化国内外还没人研究，所以利用廉价的壳聚糖作为固定化载体固定琼脂糖酶具有较大的理论和实践意义。而本方法研究的目的是开发壳聚糖的应用领域，并可以增强琼脂糖酶在工业、医学、食品、环境保护等领域的应用。
发明内容
1.本发明涉及用壳聚糖固定化琼脂糖酶的方法，其特征在壳聚糖固定化琼脂糖酶的方法，包括以下过程:步骤(一):用1.5-2% (V/V)乙酸配制1: 20(W/V)的壳聚糖溶液，充分溶解；步骤(二):将步骤(一)的壳聚糖溶液逐滴滴入lmol/L氢氧化钠溶液中，壳聚糖将凝聚成白色颗粒，过滤收集壳聚糖珠；步骤(三):将步骤(二)的壳聚糖珠用蒸馏水洗涤至中性；步骤(四):将步骤(三)的壳聚糖珠用0.2mol/L、pH7.6的磷酸缓冲溶液浸泡过夜；步骤(五):取步骤(四)中的壳聚糖珠载体2.5_5g，加入2.5%的戊二醛20-25ml，水浴振荡0.5小时，室温交联5_6小时，磷酸缓冲液冲洗壳聚糖珠交联载体；步骤(六):在步骤(五)中的壳聚糖珠交联载体中加入10_15mL稀释的琼脂糖酶液，搅拌均匀，4°C固定2-3小时，用磷酸缓冲液冲洗；步骤(七):将步骤(六)中的固定化酶抽真空得到固定化琼脂糖酶。2.根据本发明所述的制备固定化琼脂糖酶的载体是壳聚糖微球。
图1是pH值对酶活性的影响图，图2是温度对酶活性的影响图，图3是游离酶和固定化酶的热稳定性图。
具体实施例方式本发明所述的涉及壳聚糖微球固定化琼脂糖酶方法包括以下实施例，下面的实施例可进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例1:pH值对酶活性的影响平行取制备好的壳聚糖固定化酶0.5g和相应的游离酶，在不同pH(4.0-9.0)条件下分别加底物与游离酶及固定化酶作用，分别测定其酶活力，结果如图1所示。图1表明,游离酶的最适pH值为8.0，随着pH值的升高酶活性下降；对固定化酶而言，在本实验条件下，当PH值达到8.5的时候酶活性达到最大值，固定化使酶的最适pH往碱性方面升高0.5个单位，符合酶和载体结合后的基本规律。实施例2:温度对酶活性的影响平行取制备好的壳聚糖固定化酶0.5g和相应的游离酶，在不同温度(30°C -80°C )条件下分别加底物与游离酶及固定化酶作用，分别测定其酶活力，结果如图2所示。由图2可知，游离琼脂酶在40°C下表现出最高活力，随温度升高，活力急剧下降，酶开始失活，但对固定化酶而言，在40-60°C范围内均有较大酶活，50°C时酶活力达最大值，固定化酶耐热性显著提高。实施例3:游离酶和固定化酶的热稳定性平行取制备好的壳聚糖固定化酶0.5g和相应的游离酶，在不同温度(20°C -80°C )条件下保温0.5h，然后加底物与其作用，分别测定其酶活力，结果如图3所示。由图3可知，酶液在40°C以下短暂保温对酶活影响较小，温度进一步提升至50°C时对游离酶活性影响增加，损失约为27.36%，而对固定化酶活力影响仍较小。在60°C时，游离酶的活性很低，而固定化酶活约为50%，70°C时酶基本都已完全没有活性，说明固定化酶的热稳定性高于游离酶。实施例4:固定化酶的操作稳定性取固定化酶0.5g，加0.5%琼脂糖底物1.5ml与之反应，连续操作6次，分别测定6次反应后的酶活力大小,结果如表I。表I固定化琼脂酶的操作稳定性
权利要求
1.本发明涉及用壳聚糖固定化琼脂糖酶的方法，其特征在壳聚糖固定化琼脂糖酶的方法，包括以下过程: 步骤(一):用1.5-2% (V/V)乙酸配制1: 20(W/V)的壳聚糖溶液，充分溶解； 步骤(二):将步骤(一)的壳聚糖溶液逐滴滴入lmol/L氢氧化钠溶液中，壳聚糖将凝聚成白色颗粒，过滤收集壳聚糖珠； 步骤(三):将步骤(二)的壳聚糖珠用蒸馏水洗涤至中性； 步骤(四):将步骤(三)的壳聚糖珠用0.2mol/L、pH7.6的磷酸缓冲溶液浸泡过夜；步骤(五):取步骤(四)中的壳聚糖珠载体2.5-5g，加入2.5%的戊二醛20-251111，水浴振荡0.5小时,室温交联5-6小时,磷酸缓冲液冲洗壳聚糖珠交联载体； 步骤(六):在步骤(五)中的壳聚糖珠交联载体中加入10-15mL稀释的琼脂糖酶液，搅拌均匀，4°C固定2-3小时，用磷酸缓冲液冲洗； 步骤(七):将步骤(六)中的固定化酶抽真空得到固定化琼脂糖酶。
2.根据本发 明所述的制备固定化琼脂糖酶的载体是壳聚糖微球。
全文摘要
本发明所属酶工程研究开发技术领域。本发明涉及一种琼脂糖酶的固定化方法研究。用1.5-2％(V/V)乙酸配制1∶20(W/V)的壳聚糖溶液，充分溶解；溶解后的壳聚糖溶液逐滴滴入1mol/L氢氧化钠溶液中，过滤收集壳聚糖珠；用蒸馏水洗涤至中性，再用0.2mol/L、pH7.6的磷酸缓冲溶液浸泡过夜；取浸泡的壳聚糖珠载体2.5-5g，加入2.5％的戊二醛20-25ml，水浴振荡0.5小时，室温交联5-6小时，磷酸缓冲液冲洗壳聚糖珠交联载体；在壳聚糖珠交联载体中加入10-15mL稀释的琼脂糖酶液，搅拌均匀，4℃固定2-3小时，用磷酸缓冲液冲洗；抽真空得到固定化琼脂糖酶。本发明制备固定化酶的方法，载体廉价易得，工艺简单，条件温和，对酶活性损失小，酶活回收率可达到77.6％。
文档编号C12N11/10GK103232988SQ201310128450
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月4日 优先权日2013年4月4日
发明者朱启忠, 张瑞, 张扬 申请人:山东大学(威海)