专利名称：一种枣树ssr标记分子遗传图谱的构建方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、遗传学和基因组学领域，特别是指一种枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法。
背景技术：
枣树属于鼠李科枣属，是原产我国的特有果树，种质资源极其丰富，遗传背景复杂，迄今至少已有7000年的栽培历史。在长期的自然演化和人工选择过程中，形成了丰富的变异，至今已经发现和记载的枣树品种和优良类型达880多种。但是由于缺乏大量的多态性分子标记，其遗传学和基因组学方面的研究相对比较滞后。申莲英构建了第一个率树分子遗传图谱(申连英.2005.率(Ziziphus jujubaMill)遗传连锁图谱构建及性状的QTL定位研究)，包括分布在14个连锁群的333个AFLP(amplified fragment length polymorphism限制性片段长度多态性标记)标记，覆盖基因组长度1237.4cM，平均图距为3.9cM。齐靖等(齐靖，董祯，毛永民，等.枣高密度遗传图谱的构建与树干直径的QTL分析.林业科学，2009，45 (8):44-49)对该图谱进行加密至 388 个 AFLP 标记和 35 个 RAPD (random amplified polymorphic DNA 即随机扩增多态性DNA标记)标记由15个连锁群，覆盖基因组总长度1309.4cM，标记间平均距离3.1cM0但该图谱缺乏通用性的共显性标记，相对难以进行整合。因此，以共显性SSR标记构建框架遗传图谱，对枣树分子育种的发展具有重要的意义。RAPD、AFLP 和 SRAP(Sequence-related amplified polymorphism 即相关序列扩增多态性)标记等被用于枣树的品种分类和亲缘关系分析。但这些标记由于显性特点等原因，加上新的标记的出现，渐渐较少用于遗传图谱构建。SSR(Simple sequence repeat简单重复序列)标记，又叫微卫星(Microsatellites)标记,具有数量丰富、共显性、重复性、实验技术简便等突出的优点，因此越来越多的作为锚定标记被应用到众多物种的遗传图谱构建，尤其是框架遗传图谱构建。此外，SSR还被广泛应用于遗传多样性分析、指纹图谱、遗传图谱的构建中。本发明人利用磁珠富集法开发了冬枣SSR标记引物240对，筛选其中的多态引物构建枣树的分子遗传图谱，从而进行相关性状的QTL定位，可以推动枣树重要性状的遗传控制研究和分子标记辅助育种的进程。
发明内容
本发明的目的是提供一种枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法。一种枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤:I) DNA的提取:提取待测枣树亲本和子代的基因组DNA ；2) SSR标记引物的筛选:以亲本材料筛选SSR标记引物；3)PCR扩增:分别利用上述SSR标记引物，各自以待测枣树亲本和子代的基因组DNA为模版，进行PCR扩增；4)图谱构建:利用生物学软件分析PCR扩增结果，构建枣树SSR标记分子遗传图P曰。其中，所述步骤I)中所述待测枣树亲本是以冬枣为母本，以映山红为父本；所述子代为149株F1代的子代。其中，所述步骤I)中所述DNA的提取使用改良后的CTAB法，具体步骤如下:(I)取适量CTAB提取液放入65°C水浴锅中预热待用；(2)取枣树叶片0.5g，放入研钵中，加入少量PVP-40，在液氮中迅速研磨成粉末状，转移至装有lml65°C预热的CTAB提取液(用前加2% β -巯基乙醇混匀)的离心管中(用前做灭菌处理)；(3)将所述离心管旋涡剧烈振荡，充分混匀，放入65°C水浴锅中，水浴50min，每隔IOmin上下翻动离心管助充分混匀；(4) I2OOOrpm 常温下离心 IOmin ；(5)取上清液于新的离心管中(注意吸取时不要触及分界面，以免带入杂质)，加入等体积水饱和酚/氯仿/异戊醇混合液(25: 24: I)(现用现配)，轻轻颠倒混匀，室温放置IOmin ；(6) I2OOOrpm 常温下离心 I Omin ；(7)取步骤(6)所得上清液于新的离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24: I)再次抽提；(8)取步骤(7)所得上清液于新的离心管中，加等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，放置于_20°C冰箱中沉淀20min ；(9)挑出DNA絮状沉淀到2ml离心管中，用70%乙醇清洗沉淀2次，每次30min ；(10)在超净工作台中用无菌风吹干沉淀，加入100μ I TE缓冲液溶解DNA，于-20°C保存待用。其中，所述步骤2)中所述SSR引物的筛选基于磁珠富集法，开发冬枣SSR引物，利用母本冬枣和父本映山红进行SSR引物筛选，挑选母本冬枣和父本中至少一方表现为杂合的引物作为核心引物。其中，所述步骤2)中所述SSR引物如表3中所示的240对引物。其中，所述步骤2)中所述SSR引物如表3中所示的170对核心引物。其中，所述步骤2)还包括检测提取的DNA的质量。其中，所述步骤3)PCR扩增采用的是三引物法，即由在正向引物的5’端加上M13尾巴序列、特异反向引物以及带有荧光标记的通用型M13引物。其中，所述带有荧光标记的通用型Ml3引物如表I中所示。其中，所述步骤3) PCR扩增之后还包括对PCR扩增后的结果进行检测，采用毛细管电泳检测。其中,所述步骤4)中所述生物学软件为Genemarker V1.75软件,读取后的数据经过FlexiBinv2程序矫正后用于后续分析。其中，所述步骤4)中分别对PCR扩增结果进行X 2检验，分析其是否符合孟德尔分离定律，在5%的显著水平下找到偏分离标记并去除，分别将三种分离形式(I: 1、1: 2: 1、1:1:1:1)的标记类型转化为统一的格式，选用全同胞群体遗传图谱构建软件FslinkageMAP进行分子遗传图谱的构建。
本发明的有益效果如下:1、提供了枣树的170对核心引物，建立了高效的枣树SSR标记分析技术体系。2、采用FslinkageMAP作图软件,能够利用Mapmaker和Joinmap不能利用的标记，提闻标记的利用效率。3、采用毛细管电泳SSR基因型分型技术，提高实验的效率和准确性。4、SSR标记分析过程中采用8 μ I的PCR扩增体系，降低实验成本。本发明利用磁珠富集法开发了冬枣SSR引物240对，筛选其中的SSR引物构建枣树的遗传图谱，从而进行相关性状的QTL定位，可以推动枣树重要性状的遗传控制研究和分子标记辅助育种的进程。
图1为本发明实施例的率树SSR标记分子遗传图谱。
具体实施例方式为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将在具体实施例进行详细描述。如果没有特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域普通技术人员熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。本发明实施例提供的枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，包括:步骤I提取DNA所述枣树的基因组DNA提取方法，采用改良后的CTAB法，具体步骤如下:步骤11取适量CTAB提取液放入65 °C水浴锅中预热待用；
步骤12取枣树叶片0.5g，放入研钵中，加入少量PVP-40，在液氮中迅速研磨成粉末状，转移至装有lml65°C预热的CTAB提取液(用前加2% β -巯基乙醇混匀)的离心管中(用前做灭菌处理)；步骤13旋涡剧烈振荡，充分混匀，放入65°C水浴锅中，水浴50min，每隔IOmin上下翻动离心管助充分混匀；步骤1412000rpm 常温下离心 IOmin ；步骤15取上清液于新的离心管中(注意吸取时不要触及分界面，以免带入杂质)，加入等体积水饱和酚/氯仿/异戊醇混合液(25: 24: I)(现用现配)，轻轻颠倒混匀，室温放置IOmin ；步骤1612000rpm 常温下离心 IOmin ；步骤17取步骤16所得上清液于新的离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24: I)再次抽提；步骤18取步骤17所得上清液于新的离心管中，加等体积_20°C遇冷的异丙醇沉淀DNA，轻轻颠倒混匀，放置于_20°C冰箱中沉淀20min ；步骤19挑出DNA絮状沉淀到2ml离心管中，用70%乙醇清洗沉淀2次，每次30min ；步骤20在超净工作台中用无菌风吹干沉淀，加入100μ I TE缓冲液溶解DNA，于-20°C保存待用。
用此方法提取以枣树品种‘冬率’为母本的DNA，以‘映山红’为父本的DNA，以及149株F1代的DNA，分别得到各自的DNA样品液。步骤2检测DNA分别取3 μ I步骤I所得的DNA样品液，在超微量紫外分光光度计上测量其DNA含量(μ g/ml)、A260nm/A280nm的值及其在260nm处的吸收峰，检测DNA的纯度。分别取5μ I步骤I所得DNA样品混合I μ 16 X Loading Buffer,在浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳中检测DNA的完整性。步骤3筛选、扩增及检测选择本发明人利用磁珠富集法开发的240对‘冬率’ SSR标记引物，利用2个亲本材料‘冬枣’和‘映山红’进行SSR引物筛选，SSR标记引物(见表3:240对SSR引物信息表)由金唯智(北京)生物科技有限公司合成，挑选在‘冬枣’和‘映山红’中至少一方表现为杂合的引物，并且随机挑选子代DNA进行扩增检测，挑选出扩增效果稳定、无杂带、信号较强的170对SSR核心引物(见表3所示)用于分子遗传图谱的构建。本发明利用三引物法PCR(即由在正向引物的5’端加上M13尾巴序列、特异反向引物以及带有荧光标记的通用型M13引物，荧光标记的通用型M13引物见表1(M13荧光引物表)，利用毛细管电泳技术同时检测不同荧光染料标记的多个SSR位点)扩增SSR位点。PCR反应体系包括:2xTaq PCR预混溶液(北京博迈德科技发展有限公司)4 μ 1，正向引物(1μΜ)0.32μ I,反向引物(I μ Μ) 1.28 μ 1，Μ13 引物(I μ Μ) 1.28 μ 1，模版DNA0.80 μ 1，ddH200.32 μ 1，总体积 8.00 μ I。PCR 扩增程序:步骤 I:94°C 5 分钟；步骤 2:94°C 30 秒，55°C 40 秒，72°C 45 秒，共 30 循环；步骤 3 -MV 30 秒，53°C 40 秒，72°C 45 秒，共8循环；步骤4:72°C 10分钟；步骤5:10°C保存。扩增结果送金唯智(北京)生物科技有限公司进行毛细管电泳检测。步骤4结果处理利用Genemarker V1.75 (Soft Genetics LLC, USA)软件读取毛细管电泳原始数据，读取后的数据经过FlexiBinV2程序矫正后用于后续分析。在240对SSR引物的筛选过程中，共挑选出170对扩增稳定、基本无杂带并且信号较强的SSR核心引物用于后续的分子图谱构建。步骤5偏分离标记检测分别对170个扩增结果的子代分离情况进行X 2检验，分析其是否符合孟德尔分离定律，在5 %的显著水平下找到偏分离标记，有57对标记在5 %的显著水平下确定为偏分离标记，偏分离比率为33.5%，在构建分子遗传连锁图谱时将偏分离标记去除。步骤6分子遗传图谱的构建分别将113个所扩增出的分离形式的类型(1: 1、1: 2: 1、1:1:1:1)转化为统一的格式，用全同胞群体遗传图谱构建软件FslinkageMAP构建的枣树分子遗传图 图1为本发明实施例的枣树SSR标记分子遗传图谱，左边数据表示两个标记之间的相对距离，右边表示所用标记编号。根据图谱结果，作图的113个标记，有106个标记被定位在图谱上，标记利用率为93.8%，构建出一张包含16个连锁群，总长为579.86cM的遗传连锁图谱，平均图距为5.47cM，最长的连锁群包含15个标记，总长为91.66cM，平均图距为6.llcM(参见表2:SSR标记在图谱上的分布)；最短的连锁群包含4个标记，总长为3.90cM，平均图距为0.98cM。表2显示的是详细的图谱信息。表I
权利要求
1.一种枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)DNA的提取:提取待测枣树亲本和子代的基因组DNA ； 2)SSR标记引物的筛选:以亲本材料筛选SSR标记引物； 3)PCR扩增:分别利用上述SSR标记引物，各自以待测枣树亲本和子代的基因组DNA为模版，进行PCR扩增； 4)图谱构建:利用生物学软件分析PCR扩增结果，在5%的显著水平下下找到偏分离标记并去除,构建枣树SSR标记分子遗传图谱。
2.根据权利要求1所述的枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤I)中所述待测枣树亲本是以冬枣为母本，以映山红为父本；所述子代为149株F1代的子代。
3.根据权利要求1所述的枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤I)中所述DNA的提取使用改良后的CTAB法，具体步骤如下: (1)取适量CTAB提取液放入65°C水浴锅中预热待用； (2)取枣树叶片0.5g，放入研钵中，加入少量PVP-40，在液氮中迅速研磨成粉末状，转移至装有lml65°C预热的CTAB提取液的离心管中； (3)旋涡剧烈振荡，充分混匀，放入65°C水浴锅中，水浴50min，每隔IOmin上下翻动离心管，充分混勻； (4)12000rpm 常温下离心 IOmin ； (5)取上清液于新的离心 管中，加入等体积水饱和酚/氯仿/异戊醇混合液，其配比为25:24:1，轻轻颠倒混匀，室温放置IOmin ； (6)12000rpm 常温下离心 IOmin ； (7)取步骤(6)所得上清液于新的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，其配比为24:1，再次抽提； (8)取步骤(7)所得上清液于新的离心管中，加等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，放置于_20°C冰箱中沉淀20min ； (9)挑出DNA絮状沉淀到2ml离心管中，用70%乙醇清洗沉淀2次，每次30min； (10)在超净工作台中用无菌风吹干沉淀，加入100μ I TE缓冲液溶解DNA，于-20°C保存待用。
4.根据权利要求2所述的枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤2)中所述SSR标记引物为表3中所示的240对引物；所述步骤2)中所述SSR标记引物的筛选基于磁珠富集法，开发冬枣SSR引物，利用母本冬枣和父本映山红进行SSR标记引物筛选，挑选母本冬枣和父本中至少一方表现为杂合的引物作为核心引物。
5.根据权利要求4所述的枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述核心引物为表3中所示的170对核心引物。
6.根据权利要求4或5所述的枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤2)包括检测提取的DNA的质量。
7.根据权利要求6所述的枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤3 ) PCR扩增采用的是三引物法，即由在正向引物的5 ’端加上Ml3尾巴序列、特异反向引物以及带有荧光标记的通用型M13引物。
8.根据权利要求7所述的枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤3) PCR扩增之后还包括对PCR扩增后的结果进行检测，采用毛细管电泳检测。
9.根据权利要求8所述的枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中所述生物学软件为Genemarker V1.75软件,读取后的数据经过FlexiBinv2程序矫正后用于后续分析。
10.根据权利要求1所述的枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中分别对PCR扩增结果进行X 2检验，分析其是否符合孟德尔分离定律，在5%的显著水平下找到偏分离标记并去除，分别将三种分离形式:1:1、1:2:1、1:1:1:1的标记类型转化为统一的格式，选用全同胞群体遗传图谱构建软件FslinkageMAP进行分子遗传图谱的构建 。
全文摘要
本发明公开一种枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，包括如下步骤1)提取待测枣树亲本和子代的基因组DNA；2)以亲本材料筛选SSR引物；3)分别利用上述SSR引物，各自以待测枣树亲本和子代的基因组DNA为模版，进行PCR扩增；4)利用生物学软件分析PCR扩增结果，构建枣树SSR标记分子遗传图谱。本发明建立了高效低成本的枣树SSR标记技术体系，获得的SSR标记和核心引物组，具有高效性、稳定性和共显性等优点。利用该套标记可以进行枣树遗传图谱构建、遗传多样性分析、品种鉴定和分子标记辅助育种等研究，推动枣树遗传学和育种技术的发展。
文档编号C12Q1/68GK103173562SQ201310127570
公开日2013年6月26日 申请日期2013年4月12日 优先权日2013年4月12日
发明者庞晓明, 王斯琪, 李颖岳, 刘君, 续九如 申请人:北京林业大学