专利名称：一种microRNA检测探针和检测microRNA的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和核酸化学领域，涉及一种microRNA检测探针和检测microRNA的方法。
背景技术：
微RNA (microRNAs ；miRNA,又译小分子RNA)是真核生物中广泛存在的一种长约21到23个核苷酸的RNA分子，可调节其他基因的表达。miRNA来自一些从DNA转录而来，但无法进一步转译成蛋白质的RNA (属于非编码RNA)。miRNA通过与靶信使核糖核酸(mRNA)特异结合，从而抑制转录后基因表达，在调控基因表达、细胞周期、生物体发育时序等方面起重要作用。在动物中，一个微RNA通常可以调控数十个基因。这些RNA是从初级转录本(primary transcript),也就是pr1-miRNA,转变成为称为pre-miRNA的莖环结 构,最后成为具有功能的miRNA。pr1-miRNA长度大约为300 1000个碱基，pr1-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA即microRNA前体,长度大约为70 90个喊基；pre_miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约2(T24nt的成熟miRNA。实际研究中,pre-miRNA应用最早,也最广泛。近年研究发现microRNA的双臂对成熟miRNA的形成有着十分重要的作用。与小分子siRNAs相比，miRNA在分子特性等方面是相似的，但也存在不少的差异。siRNA是双链RNA，3 ‘端有2个非配对碱基，通常为UU ; miRNA是单链RNA。 siRNAs是由dsDNA在Dicer酶切割下产生,而成熟miRNAs的产生要复杂一些,首先pr1-miRNA在核内由一种称为Drosha酶处理后成为大约70nt的带有莖环结构的Precursor miRNAs(pre-miRNAs),这些pre-miRNAs再在Exportin_5帮助下转运到细胞核外之后再由胞质Dicer酶进行处理,酶切后成为成熟的miRNAs。生命的一些重要活动如幼虫的生长发育、细胞的发生和分化、神经系统的分化等都被一些非编码蛋白的小RNA的调控，而除miRNA、siRNA以外的小RNA我们目前知之甚少。研究发现HiiCT0RNA可以作为重要的疾病标志物，抑制研究已经证实其与多种重大疾病息息相关，在很多疾病的早期阶段，microRNA谱会有特征性的异常。因此如果能够在microRNA变异的早期能够及时的加以检测，将会大大有助于重大疾病的早期预警、早期诊断以及预后治疗。microRNA由于重要性引起了广泛的研究兴趣，发展针对它们的检测方法受到了科学家们的极大重视，但是到目前为止，还没有非常好的检测方法。传统的northern杂交方法灵敏度十分有限，而基于芯片的检测方法虽然具有通量高的优点，但是价格十分昂贵且依赖于大型昂贵仪器的配套使用，局限性很大。因此发展新型的microRNA检测方法，灵敏、低成本对microRNA加以检测，十分重要。发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种microRNA特异性的检测探针和高灵敏低成本检测microRNAs的方法。本发明是基于磁珠分离和DNA酶扩增检测microRNA。本发明的直链探针由三部分组成，中间区域为与靶标HiiCT0RNA互补的的单链DNA,所述单链DNA的一端连着DNA酶，作为信号输出部分，所述单链DNA另一端为标记上的生物素，其长度为7-10碱基。本发明探针的检测原理是:含目标microRNA的体系中加入探针，探针的单链DNA与microRNA互补配对，双链特异性核酸酶(DSN)选择性的消化DNA-RNA杂交的DNA链，RNA完好无损，可以循环使用，再与其他探针结合，达到信号放大的效果。被切断的探针分为两部分，一部分是含有生物素标记的单链DNA，另一部分是含有具有催化活性的DNA酶。链霉亲和素磁珠加入到每个反应体系中，然后通过铁磁体将磁珠连同未反应的探针和切断的生物素标记的单链DNA从水溶液中去除。含DNA酶的溶液部分用于进一步的信号输出反应。不同种类的DNA酶均可以用于本发明探针检测microRNA，包括DNA过氧化物酶、8-17脱氧核酶或者10-23脱氧核酶等。DNA过氧化物酶，即单链鸟嘌呤富含序列，为18个碱基，形成G _4链体，具有DNA过氧化物酶活性。8-17 DNA核酶对底物序列具有好的消化活性，产生荧光信号。本发明还提供检测microRNAs的方法,其包括如下步骤:
I)根据待测靶标microRNA设计合成本发明所述的检测探针。2)向待测体系中加入探针，浓度为ΙΟΟηΜ，探针中的单链DNA与标靶microRNA以碱基配对结合，再向待测体系中加入双链特异性核酸酶，59摄氏度反应30分钟，切断结合的探针，使之分为两部分，一部分是生物素标记的单链DNA，另一部分是DNA酶；
3)将链霉亲和素磁珠加入到待测体系中，37摄氏度孵育30分钟，通过铁磁体将磁珠连同未反应的探针和切断的生物素标记的单链DNA从水溶液中去除，室温作用；
4)含有DNA酶部分的水溶液孵育后，加入底物，通过检查动力学来检测相应标靶microRNAο在待测体系中，双链特异性核酸酶用量为0.2 U。不同种类的DNA酶均可以用于本体系的检测，包括DNA过氧化物酶、8_17脱氧核酶或者10-23脱氧核酶等。若探针连接的DNA酶是DNA过氧化物酶，反应是在含有氯高铁血红素和高浓度钾离子的溶液中孵育，然后做DNA过氧化物酶催化过氧化氢氧化ABTS的动力学测试。若连接的DNA酶是8-17脱氧核酶，在含高浓度镁离子的Tris-HCl缓冲液孵育，然后加入8-17脱氧核酶的底物，然后进行荧光的动力学检测。DNA过氧化物酶检测极限为50 pM，8-17脱氧核酶检测限更好，可以低到2pM。为方便使用，本发明还提供包括含有上述microRNA检测探针的试剂盒。本发明的优点和有益效果在于:
本发明的检测探针，每一个探针针对一个特定的microRNA序列，特异性较强；只需单一探针，不需要额外模板序列。试验结果表明，荧光和色度检测系统是有效的miRNA方法，其中有温和的背景和明显的信号增强；探针对靶标的特异性识别，在其他不与之完全配对的microRNA存在的情况下不产生明显增强信号；所有结果均仅用荧光或者紫外-可见检测即可明确地区分祀标microRNA。与一些已知的miRNA的探针相比,设计进一步简化,在未经任何二级结构的引入，利用在5’末端decaA段标记上生物素，利用链霉亲和素-生物素系统，我们将没有参与反应的探针束缚在固相，分离未反应的探针。本发明的检查方法具有很低的检出限。使用DNA过氧化物酶检测极限为50 pM，使用8-17脱氧核酶检测限更好，可以低到2pM。
图1.比色或者荧光增强检测microRNA示意图。图2.针对miR141的比色检测梯度图。图3.比色检测microRNA特异性检测示意图。图4.针对miR141的荧光检测梯度图。图5.突光检测microRNA的特异性检测不意图。
具体实施例方式以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。实施例1
1.microRNAs检测探针体系的设计
(I)如图1所示，探针从大连 宝生物公司合成，探针针对的是miR141序列，其序列为:UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG(SEQ ID No I)，miR141是一种重要的肿瘤标志物。探针包含三个部分，与靶microRNA互补区，该区域负责识别相应的microRNA，形成DNA-RNA杂交双链结构。一端标记上生物素，利用链霉亲和素-生物素系统，将没有参与反应的探针束缚在固相，分离未反应的探针。另一端连接上DNA酶，作为信号输出部分。探针序列为:biotin-TTTTTTTTTTT CCATCTTTACCAGACAGTGTTA TGGGTAGGGCGGGTTGGG(SEQ ID No 2)。(2)所需达到的检测目标:对于相应靶标microRNA探针能产生很好信号响应，荧光和紫外-可见应可以达到明显差别，并且对非靶标miCToRNA不产生背景。2.验证探针的灵敏性和选择性 实验过程
I)DSN消化实验过程
此反应是在IXDSN缓冲溶液中，其中包含的50mM的Tris-HCl，5mM的氯化镁，I mMDTT，pH=8.0。配成25 μ L的样品体系，在59°C温育20分钟，然后在25分钟内冷却至室温。所用的配方如下:500 nM生物素标记的探针，0.20 U的DSN和不同浓度的microRNA。2 ) DNA过氧化物酶反应
DSN消化样品(每个25 μ L)与15 μ L的抗生蛋白链菌素涂覆的有孔玻璃珠在37°C下孵育30分钟，然后通过铁磁体分离。将所得的上清液，加入缓冲溶液，在95°C下孵育5分钟。缓冲溶液配方是:氨水(PH8.0)，20mM的KCl和200mM的NaCl的25mM的HEPES。孵育后的样品在室温下放置一个小时，然后加入氯化血红素，使其终浓度为125 nM。将样品在室温下再放置I小时，然后ABTS2和过氧化氢加入其中，二者的最终浓度分别为2mM。日本岛津UV-2550紫外可见分光光度计进行检测，选用动力学模式。3)实验过程8-17核酶反应DSN消化样品(每个25 μ L)与15 μ L的抗生蛋白链菌素涂覆的有孔玻璃珠在37°C下孵育30分钟，然后通过铁磁体分离。将所得的上清液，加入缓冲溶液，其含有66 mM的TRIS-HCl (pH值7.6)和6.6 mM的二价镁离子，然后加入底物MB，使终浓度为0.1 μ M。LS55Perkin Elmer公司的荧光仪器在动力学模式下进行检测。激发和发射波长分别为494 nm和 518 nm。探针灵敏性分析
用各种不同浓度的miCToRNA做实验得到的探针的灵敏性结果。如图2所示，在miR141的浓度范围是1_100 nM, UV吸收率随着miR141的浓度增加而迅速增加。miR141在的浓度小于I nM时，紫外吸收度的增加率没有显着增加。如图4所示，当miR141浓度在I nM以上，荧光强度随着miR141的浓度增加而迅速增强。当miR141浓度小于IOOpM时 ，荧光强度缓慢增加。生物素标记的DNA过氧化物酶检测极限为50 PM，生物素标记的8-17脱氧核酶检测限更好，可以低到2pM。探针选择性分析:
如图3所示，我们用miR429作为祀标，它是miR141的同源序列。体系所用探针B-141-G4，它是特异性检测miR141。可观察到miR141被miR429替换，紫外吸收值明显减小。如图5所示，8-17脱氧核酶系统中，有类似的现象。结果表明，这两个系统有良好的特异性。
权利要求
1.一种microRNA检测探针，由三部分组成，中间区域为与祀标microRNA互补的的单链DNA,所述单链DNA的一端连着DNA酶，作为信号输出部分，所述单链DNA另一端为标记上的生物素，其长度为7-10碱基。
2.根据权利要求1所述的miciORNA检测探针，其特征在于，所述DNA酶包括DNA过氧化物酶、8-17脱氧核酶或者10-23脱氧核酶。
3.—种检测microRNA的方法,其特征在于,包括如下步骤: 1)根据待测靶标microRNA设计合成本发明所述的检测探针； 2)向待测体系中加入探针，浓度为ΙΟΟηΜ，探针中的单链DNA与标靶microRNA以碱基配对结合，再向待测体系中加入双链特异性核酸酶，59摄氏度反应30分钟，切断结合的探针，使之分为两部分，一部分是生物素标记的单链DNA，另一部分是DNA酶； 3)将链霉亲和素磁珠加入到待测体系中，37摄氏度孵育30分钟，通过铁磁体将磁珠连同未反应的探针和切断的生物素标记的单链DNA从水溶液中去除，室温作用； 4)含有DNA酶部分的水溶液孵育后，加入底物，通过检查动力学来检测相应标靶microRNAο
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在待测体系中，双链特异性核酸酶用量为0.2 U。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，探针连接的DNA酶是DNA过氧化物酶，含有DNA酶部分的水溶液在含有氯高铁血红素和10 mM钾离子的溶液中孵育。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，探针连接的DNA酶是8-17脱氧核酶，含有DNA酶部分的水溶液在含5mM镁离子的Tris-HCl缓冲液孵育。
7.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，待测标靶microRNA为miR141或miR429。
8.含有权利要求1所述microRNA检测探针的试剂盒。
全文摘要
本发明涉及一种microRNA检测探针和检测microRNA的方法。检测探针，由三部分组成，中间区域为与靶标microRNA互补的单链DNA，所述单链DNA的一端连着DNA酶，作为信号输出部分，所述单链DNA另一端为标记上的生物素。待测体系中加入探针，探针的单链DNA与标靶microRNA互补配对，DSN选择性的消化DNA-RNA杂交的DNA链，RNA循环使用。加入链霉亲和素磁珠，通过铁磁体将磁珠连同未反应生物素标记的探针从水溶液中去除。溶液部分仍然用于进一步的信号输出反应。本发明的检查方法采用DSN放大加上核酶放大，是一个低背景高灵敏度特异性强的检测microRNA方法。
文档编号C12Q1/68GK103160611SQ20131012638
公开日2013年6月19日 申请日期2013年4月12日 优先权日2013年4月12日
发明者周翔, 彭双, 王少儒, 田沺, 翁小成 申请人:武汉大学