扁桃拟茎点霉TaqMan荧光定量PCR引物及探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种扁桃拟茎点霉TaqMan巧光定量PCR引物及探针，属于生物技术领 域，适用于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部口使用。
【背景技术】
[0002] 扁桃拟茎点霉(无性态:Phomopsis amygdali，有性态:Diapo;rthe amygdali)是重 要的植物病原菌，对桃、红叶李、花梅、梨和杏等多种菩薇科植物均有致病性，但在桃树上引 起的桃鎌缩溃瘍病尤为严重。常表现为在桃树新梢嫩枝的基部形成环状褐色病斑，致使枝 条病部W上叶片快速枯萎脱落，病害蔓延扩展迅速，可造成20~50%的产量损失，严重的致 使桃树整株死亡。自1905年起，Delacroix等首次报道了法国发生桃树溃瘍病之后，意大利、 美国、日本等地也相继发现该病。在中国，桃溃瘍病出现的相对较晚，直到20世纪80年代后 期才有有关该病发生流行的报道，并且起初该病只在迂宁、云南、山东、河南的局部地区发 现，危害范围较小。2008年之后，桃溃瘍病在江苏无锡、常州和浙江嘉兴等我国南方桃区相 继发生且逐年加重。尤其在2013年，江苏无锡桃溃瘍病大暴发，给当地桃产业造成了严重的 损失，严重影响了桃农生产的积极性，已逐渐成为阻碍我国桃产业持续健康快速发展的重 要因素之一。
[0003] 对于扁桃拟茎点霉进行早期检测可W及时采取防治措施，控制病害的进一步扩 展。目前，扁桃拟茎点霉的检测技术主要为传统检测法和常规PCR检测方法。传统检测法是 对病健交界处进行组织分离培养，观察病原菌形态、培养性状并回接到寄主植物观察致病 性的过程，但其费时费力，不适合病害的早期检测。随着分子生物学的快速发展，戴富明等 将常规PCR检测法引入到桃溃瘍病病菌的检测中，灵敏度达到lOOfg/L，且花费时间短，检测 效率高。
[0004] 化qMan巧光定量PCR法是在常规PCR的基础上，增加 1条双巧光标记的特异性核酸 杂交探针，通过检测巧光信号强弱来监测PCR反应过程中扩增产物量的变化。与常规PCR相 比巧光探针杂交信号不需经过琼脂糖凝胶电泳，有效避免了交叉污染和假阳性的产生，具 有省时省力、灵敏度高、特异性强、重复性好及病原定量等优点，已成为病原定量检测的重 要方法。张甜甜等将表现植原体症状的野魏豆植株同时进行巢式PCR和巧光定量PCR检测， 结果显示巢式PCR检测时有目的条带，但测序分析并非植原体，运与巧光定量PCR检测中未 发现巧光信号的增加结果相符。王恒波等利用巧光定量PCR法对甘薦宿根矮化病菌 (Leifsonia xyli subsp.xyli)样品进行检测，结果显示巧光定量PCR阳性检出率达到常规 PCR检出率的两倍。W上研究表明，巧光定量PCR法能够提供较常规PCR更高的专化性和灵敏 度。迄今，尚未有利用化qMan巧光定量PCR方法对扁桃拟茎点霉进行检测的报道。
[0005] 病原生物的分子生物学检测技术是当今的发展方向，检测的效果和性能，很大程 度上取决于分子检测祀标的筛选。前期研发的分子检测技术，由于缺乏基因组学的支持，分 子检测祀标没有经过系统筛选，往往造成检测结果的可信度出现问题。研究随着基因组学 的发展，越来越多的生物基因组被测序，人们已经注意到，分子检测祀标基因必须是病原生 物的核屯、基因。因此，本发明的重点之一是利用比较基因组学的方法，筛选出可供作为检测 革己标的核屯、基因。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种扁桃拟茎点霉化qMan巧光 定量PCR引物及探针，适用于扁桃拟茎点霉化qman巧光定量PCR检测，快速、灵敏、简便。
[0007] 按照本发明提供的技术方案，所述扁桃拟茎点霉化qMan巧光定量PCR引物，其特征 是:所述引物包括SEQ ID No: 1所示的上游引物histone册-F和SEQ ID No: 1所示的下游引 物histone册-R组成的引物对。
[0008] 所述用于检测扁桃拟茎点霉的探针，其特征是：包括SEQ ID No: 1所示的探针 histone H3-P。
[0009] 进一步的，所述探针histone H3-P的5'端标记巧光报告基团FAM，3'端标记巧光巧 灭基团TAMRA。
[0010] 所述检测扁桃拟茎点霉的方法，其特征是，包括W下步骤：
[0011] (1)合成上游引物histone H3-F、下游引物histone册-R和探针histone H3-P，并 对探针histone册-P进行标记；
[0012] (2)提取待检测样品的基因组DNA，W上游引物histone H3-F和下游引物histone H3-R进行扩增，得到扩增产物；
[OOU] (3)采用巧光定量PCR检测体系对待测样品进行检测。
[0014] 进一步的，所述探针histone H3-P的5'端标记巧光报告基团FAM，3'端标记巧光巧 灭基团TAMRA。
[0015] 本发明所述扁桃拟茎点霉TaqMan巧光定量PCR检测引物及探针，适用于口岸检验 检疫、农业生产、植物保护等部口使用。基于该引引物及探针建立的巧光定量PCR检测体系 可用于桃溃瘍的检测，检测方法易于操作，检测结果可靠。
【附图说明】
[0016] 图1为TaqMan巧光定量PCR标准曲线。
[0017] 图2为TaqMan巧光定量PCR特异性检测。
[001引图3为TaqMan巧光定量PCR标准品质粒灵敏度检测。
[0019] 图4为常规PCR DNA灵敏度检测。
[0020] 图5为化qMan巧光定量PCR抱子灵敏度检测。
【具体实施方式】
[0021 ]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0022] 1、菌株材料:选用56株参试菌株，包括不同年份，不同果园采集的25株扁桃拟茎点 霉(P.amygdali)及31株其他参试菌株，如表1所示。
[0023] 表 1
[0024]
[0025]
[0026] 表1中，25株曲omopsis amygdali中，11株于2014年在江苏无锡进行分离，9株于 2015年在江苏无锡进行分离，2株于2014年在上海进行分离，3株于2014年在浙江嘉兴进行 分离。
[0027] 表1 中NJAU代表化njing Agricultural University(南京农业大学），JSCIQ代表 Jiangsu Entiy-Exit Inspection and 如arantine Bureau(江苏出入境检验检疫局）。
[0028] 2、检测样品：结合桃鎌缩溃瘍病的田间发病症状，于2015年在江苏无锡多个桃园 采集了 50份疑似发病样品。
[0029] 3、实验试剂与仪器：
[0030] 巧光定量PCR所用引物及探针由上海Invi化ogen有限公司合成，巧光定量PCR和普 通PCR所用试剂、PMD19-T vector连接试剂盒、质粒提取纯化试剂盒均购于大连宝生物公 司，真菌基因组DNA提取试剂盒购于OMEGA公司，美国ABI-7500实时巧光PCR扩增仪、Thermo Nanno化op 1000分光光度计、Eppendo;rf Master巧cler pro 384梯度PCR扩增仪、DYY-8C双 稳定时电泳仪(北京六一仪器厂）、培清JS-780全自动凝胶成像分析系统。
[0031] 4、检测方法：
[0032] (1)核酸提取：扁桃拟茎点霉、参试近缘菌株及实际样品检测中病样的基因组DNA 均由OMEGA公司的真菌基因组DNA小量制备试剂盒提取，具体步骤详见说明书。
[0033] (2)特异性引物探针的设计合成:根据GenBank登录的扁桃拟茎点霉histone册基 因（登录号:KC343503)的保守区域，利用Bioedit软件进行序列比对分析，设计巧光定量检 测引物化istone H3-F、histone H3-R)和探针化istone H3-P)，探针5'端标记巧光报告基 团FAM，3'端标记巧光巧灭基团TAMRA，扩增目的片段大小为130bp。引物和探针均委托上海 Invitrogen有限公司合成并纯化，引物和探针的的序列如表2所示。
[0034] 表2引物及探针序列
[0035]
[0036] (3)标准质粒的构建：W提取的扁桃拟茎点霉DM为模板，用巧光定量引物 化istone册-F、histone册-R)扩增相应片段。回收目的片段与pMD19-T simple vector连 接试剂盒连接，转化D册α感受态细胞，利用Amp抗性挑选阳性克隆子。将阳性克隆接种到LB 培养基(含Amp100 mg/L)，37°C摇菌过夜，使用质粒小量提取试剂盒提取质粒，经PCR鉴定后 委托上海Invitrogen有限公司测序验证。
[0037] 经PCR鉴定，重组质粒的扩增产物大小为13化P，与预期大小一致，表明histone H3 基因已正确插入载体PMD19-T中，其测序结果在NCBI经Blast分析显示，与参考