用于检测IFITM3-rs12252基因多态性的Taqman荧光定量RT-PCR引物和探针的制作方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于检测与人类重症流感相关的IFITM3-rsl2252基因多态性的Taqman荧光定量RT-PCR特异性引物和探针。【
背景技术：
】[0002]流感（Influenza)因其传染性强，发病率高，易引起暴发流行，严重威胁着人类的健康。虽然流感疫苗可以有效的预防流感的发生，但是流感病毒变异后可以削弱流感疫苗的效应。如2009年爆发的甲型HlNl流感，据统计，在我国确诊的12.7万例患者中，有8320例为重症及危重病例，死亡196例。由此可见，流感，尤其是重症流感已成为威胁人类健康的重大公共卫生问题。[0003]干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)位于人类第11号染色体上，是近期发现的一种具有广谱抗囊膜病毒活性的蛋白，是由I型或II型干扰素（IFN)诱导产生的，它可以通过抑制流感病毒和其他包膜病毒进入细胞而限制病毒复制，缺失IFITM3基因后，IFN的抗病毒作用会明显变弱，由此，IFITM3是人体抗病毒免疫所必需的。[0004]最新研究发现，IF頂T3的基因多态性与流感重症有关。目前，尚未发现有通过检测单个碱基突变来预测流感重症的相关报道。【
发明内容】[0005]本发明的目的是提供一种用于检测与人类重症流感相关的IFITM3-rsl2252基因多态性的Taqman荧光定量RT-PCR特异性引物和探针。[0006]本发明的另一目的是提供含有所述特异性引物和探针的用于检测与人类重症流感相关的IFITM3-rsl2252基因多态性的试剂盒。[0007]为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测与人类重症流感相关的IFITM3-rsl2252基因多态性的Taqman荧光定量RT-PCR特异性引物和探针，包括：[0008]正向引物F:5'-CTGTTGAGAAACCGAAACTACTAGG-3'；[0009]反向引物R:5，-ATGTGGATCACGGTGGACGTC-3，；[0010]PROB-T:5,-Fl-CTCCTGTCAACAGTGGCCAG-Q-3，；[0011]PROB-C:5，-F2-CTCCTGTCAACAGCGGCCAG-Q-3，。[0012]其中，Fl和F2为不同的荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。[0013]优选地，Fl为FAM，F2为HEX，Q为TAMRA。[0014]本发明还提供含有所述特异性引物和探针的用于检测与人类重症流感相关的IFITM3-rsl2252基因多态性的试剂盒。[0015]优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg'PCR反应缓冲液中的一种或多种。[0016]更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。[0017]本发明还提供所述特异性引物对及探针在检测与人类重症流感相关的IFITM3-rsl2252基因多态性中的应用。由于IFITM3的基因多态性（rsl2252-C基因型）与流感重症有关，所述特异性引物对能够有效地鉴定出IFITM3-rsl2252的不同基因型，IFITM3-rsl2252-C基因型因改变了IFITM3蛋白的N末端蛋白结构而降低其限制病毒复制的能力。根据全球千人基因组数据显示，IFITM3-rsl2252-C基因型在欧洲白种人中很罕见，而在亚洲人群中更为常见。更重要地，结合rsl2252-CC基因型易于发生流感重症的数据，分析结果表明中国人群中发生严重感染的群体归因风险度高达54.3%。有临床研究发现2009年的HlNl流感大流行时，在具有肺炎、呼吸或肾脏衰竭等严重并发症的中国患者中，69%的人携带rsl2252-CC基因型，而在病症轻微的患者中，只有25%的人携带这一遗传突变。统计分析结果显示，rsl2252-CC基因型与CT/TT基因型相比，发生严重感染的风险增加了6倍。因此，IFITM3-rsl2252基因多态性在流感的发生中起着非常重要的作用。[0018]本发明还提供鉴定与人类重症流感相关的SNP标记的方法，所述SNP标记位于IFITM3-rsl2252基因如SEQIDNO.1所示序列的142bp处，此处碱基为C的个体发生重症流感的风险显著高于此处碱基为T的个体。[0019]所述方法包括如下步骤：1)提取待测个体的基因组DNA;2)以待测个体的基因组DNA为模板，利用所述特异性引物（F和R)和探针（PR0B-T和PR0B-C)，采用Taqman荧光定量RT-PCR检测技术，根据扩增曲线结果判定待测个体IFITM3-rsl2252基因型。具体为：扩增曲线仅有IFITM3-rsl2252PR0B-T探针起跳，则待测个体IFITM3-rsl2252基因型为TT型,若扩增曲线仅有IFITM3-rsl2252PR0B-C起跳，则待测个体IFITM3-rsl2252基因型为CC型，若检测结果出现两条扩增曲线，则待测个体IFITM3-rsl2252基因型为杂合CT型。[0020]实时定量PCR反应使用的扩增体系以25μ1计为：[0021][0022]所述缓冲液混合物中含600mM三羟甲基氨基甲烷硫酸盐（pH8.9)，180mM(NH4)2S04，20mMdGTP，2mMdATP，2mMdTTP，2mMdCTP，耐热性accuprimeTM蛋白（Thermostableaccuprimeprotein),10%甘油。[0023]实时定量PCR反应使用的条件为：95°C10分钟；95°C15秒，60.9°C60秒，共40个循环，在循环的第二步开始收集荧光。[0024]本发明采用Taqman荧光定量RT-PCR技术，检测流感易感人群的基因型，根据基因型检测结果，对流感重症的出现进行预警，为控制流感重症的发生提供了可能。另外，本发明提供的基因型检测方法，为闭管式检测，具有简单、精确，污染性小，迅速快捷等优点，适于基层推广使用。【附图说明】[0025]图1为本发明实施例1中采用Taqman荧光定量RT-PCR技术检测待测个体IFITM3-rsl2252基因型为TT型的扩增曲线结果。[0026]图2为本发明实施例1中采用Taqman荧光定量RT-PCR技术检测待测个体IFITM3-rsl2252基因型为CC型的扩增曲线结果。[0027]图3为本发明实施例1中采用Taqman荧光定量RT-PCR技术检测待测个体IFITM3-rsl2252基因型为杂合CT型的扩增曲线结果。【具体实施方式】[0028]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。[0029]实施例1用于检测与人类重症流感相关的IFITM3_rsl2252基因多态性的Taqman荧光定量RT-PCR特异性引物和探针的获得[0030]根据IFITM3_rsl2252基因序列（SEQIDNO.1)设计并合成Taqman荧光定量RT-PCR特异性引物和探针，包括：[0031]正向引物F:5'-CTGTTGAGAAACCGAAACTACTAGG-3'；[0032]反向引物R:5，-ATGTGGATCACGGTGGACGTC-3，；[0033]PROB-T:5,-FAM-CTCCTGTCAACAGTGGCCAG-TAMRA-3,；[0034]PROB-C:5，-HEX-CTCCTGTCAACAGCGGCCAG-TAMRA-3，。[0035]实时定量PCR反应使用的扩增体系以25μ1计为：[0036][0037]所述缓冲液混合物中含600禮，三羟甲基氨基甲烷硫酸盐（ρΗ8.9)，180mM(NH4)2S04,20mMdGTP，2mMdATP，2mMdTTP，2mMdCTP，耐热性accuprime?蛋白(Thermostableaccuprimeprotein),10%甘油。[0038]实时定量PCR反应使用的条件为：95°C10分钟；95°C15秒，60.9°C60秒，共40个循环，在循环的第二步开始收集荧光。[0039]人基因组DNA的提取使用DNeasyBlood&TissueKit试剂盒(购自Qiagen公司）。[0040]利用引物F和R扩增出位于IFITM3-rsl2252基因序列142bp处的SNP位点，该处碱基可以为C或T，当该处碱基为T时，可与探针PROB-T结合，发出FAM荧光信号；当该处碱基为C时，可与探针PROB-C结合，发出HEX荧光信号。[0041]若扩增曲线仅有IFITM3-rsl2252PR0B-T探针起跳，则待测个体IFITM3-rsl2252基因型为TT型（图1)，若扩增曲线仅有IFITM3-rsl2252PR0B-C起跳，则待测个体IFITM3-rsl2252基因型为CC型（图2)，若检测结果出现两条扩增曲线，则待测个体IFITM3-rsl2252基因型为杂合CT型（图3)。[0042]实施例2IFITM3-rsl2252不同基因型与人类重症流感的关联分析及检测应用[0043]按照实施例1的方法，对50个人的基因组DNA样品进行TaqmanRT-PCR检测，然后，再使用基因检测的金标准一基因测序法对该50份DNA样品进行测序检测。结果表明，TaqmanRT-PCR检测实验结果与基因测序的结果100%吻合。[0044]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。【主权项】1.用于检测与人类重症流感相关的IFITM3_rsl2252基因多态性的Taqman荧光定量RT-PCR特异性引物和探针，其特征在于，包括：正向引物F:5'-CTGITGAGAAACCGAAACTACTAGG-3'；反向引物R:5'-ATGTGGATCACGGTGGACGTC-3'；PROB-T:5,-Fl-CTCCTGTCAACAGTGGCCAG-Q-3，；PROB-C:5'-F2-CTCCTGTCAACAGCGGCCAG-Q-3'；其中，Fl和F2为不同的荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，Fl为FAM，F2为HEX，Q为TAMRA。3.含有权利要求1或2所述引物和探针的用于检测与人类重症流感相关的IFITM3-rsl2252基因多态性的试剂盒。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。【专利摘要】本发明提供一种用于检测与人类重症流感相关的IFITM3-rs12252基因多态性的Taqman荧光定量RT-PCR特异性引物和探针，包括正向引物F、反向引物R，探针PROB-T和PROB-C。本发明采用Taqman荧光定量RT-PCR技术，检测流感易感人群的基因型，根据基因型检测结果，对流感重症的出现进行预警，为控制流感重症的发生提供了可能。另外，本发明提供的基因型检测方法，为闭管式检测，具有简单、精确，污染性小，迅速快捷等优点，适于基层推广使用。【IPC分类】C12Q1/68,C12N15/11【公开号】CN105018570【申请号】CN201410153178【发明人】李宁,赵艳,闫惠平,张永宏【申请人】首都医科大学附属北京佑安医院【公开日】2015年11月4日【申请日】2014年4月16日