用于肉制品中鸡源性成分掺假快速鉴别的Taqman-LNA荧光定量PCR方法及其引物和探针序列的制作方法
【专利摘要】鸡源性成分Taqman?LNA荧光定量PCR快速检测方法及其引物和锁核酸探针，涉及将锁核酸探针应用于鸡源性成分的快速鉴别，建立的Taqman?LNA荧光定量PCR方法具有快速、敏感、特异等优点，因采用样品Ct值与纯鸡肉Ct值的绝对差值作为肉制品中鸡肉掺假的判定标准，解决了肉污染引起的掺假误判和非特异性反应引起的假阳性。该方法适应于肉制品中鸡源性成分掺假的快速检测。本发明包括引物和锁核酸序列的设计及Taqman?LNA荧光定量PCR方法的建立。上游引物序列为：5’-TAGCCCTAAATCTAGATACCTCCC-3’；下游引物序列为：5’-ACCGCCAAGTCCTTAGAGTTT-3’；锁核酸探针序列为：5’-Hex-CACATGTATCCGC+CTGAGAACTACGA-BHQ1-3’。
【专利说明】
用于肉制品中鸡源性成分掺假快速鉴别的Taqman-LNA焚光定 量PCR方法及其引物和探针序列
技术领域
[0001 ]本发明属于动物源性成分鉴定的技术领域，具体涉及用Taqman-LNA荧光定量PCR 检测肉制品中的鸡源性成分掺假的方法及其引物和探针序列。
【背景技术】
[0002] 由于肉种价格差异带来的巨大利益诱惑导致世界各地肉类食品"掺假使假"事件 频发。在我国，媒体已多次曝光以低价肉制品假冒高价肉制品，或在高价肉制品中掺入低价 肉的事件。而在国外，BALLIN等对近千种肉制品的检测分析发现，有近20%的广品存在标识 与品种不完全相符现象。目前，打击肉制品掺假已成为监管部门关注的重点，而对肉制品中 动物源性成分的快速鉴别是打假的重要技术手段。
[0003] 对肉制品的掺假检测主要基于对动物源性成分的鉴别，尽管动物源性成分鉴别有 多种方法，但以检测DNA为基础的分子生物学方法，尤其是PCR技术以稳定、准确、快速等优 势而得到越来越广泛的应用。关于鸡源性成分的检测方法已有PCR、荧光PCR等多种方法。然 而，这些方法仍存在这样或那样的不足。如普通PCR技术存在操作繁琐，费时，触毒，易污染 等缺点。Taqman荧光PCR技术虽然克服了普通PCR的上述缺点，但在探针设计时，需要通过较 长的探针序列来获得较高的Tm值，在特异性目标基因序列较短的情况下，常常会因此难以 找到理想的探针序列，无法获得高效、特异的扩增效果，加上结果判定以Ct值小于一定阈值 作为阳性判定标准，存在将非特异性反应误判为阳性和将生产加工、销售过程肉污染误判 为故意掺假的可能。因此，以PCR为基础，应用改良的引物探针设计策略已逐步成为肉类鉴 别的新方向。
[0004] 针对肉源性成分鉴定存在的问题，本发明通过在Taqman探针的基础上，有目的地 将探针的一些碱基修饰成LNA碱基，从而提高探针的Tm值，缩短探针长度来增加探针的稳定 性、特异性和设计的灵活性，建立检测肉制品中鸡源性成分掺假的锁核酸探针荧光定量PCR 方法，通过采用样品Ct值与纯鸡肉Ct值的绝对差值作为肉制品中鸡源性成分掺假的判定标 准，解决了肉污染引起的掺假误判和非特异性反应引起的假阳性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于肉制品中鸡源性成分掺假快速鉴别的Taqman-LNA 荧光定量PCR方法及其引物和探针序列。包括： ⑴所述的引物和锁核酸探针的序列： 上游引物序列为：5 ' -TAGCCCTAAATCTAGATACCTCCC -3 ' ； 下游引物序列为:5'_ ACCGCCAAGTCCTTAGAGTTT -3'； 锁核酸探针序列为： 5'- Hex-CACATGTATCCGC+CTGAGAACTACGA-BHQl -3'； (2)采用步骤（1)设计的引物和探针建立鸡源性成分掺假的Taqman-LNA荧光定量 PCR检测方法。其特征在于：荧光PCR检测的反应体系为:20yL，包括10yL Probes Master 2 Xconc (包含有dNTP，Mg2+以及Taq酶等），步骤⑴设计的ΙΟμ mol/L上下游引物F/R各0.3 yL，10ymol/L Taqman-LNA 探针P 0.1yL，DNA 模板lyL，超纯水补至20yL。反应参数：95°C 811^11;95°(：，88,59°(：，258(采集荧光信号），35循环;40°(：，108.应用荧光?〇?仪自带分析软 件对实验结果进行分析处理。试验设纯鸡肉DNA阳性对照和空白对照。阳性对照Ct值彡20， 空白对照无 Ct值，试验有效，|样品Ct值-阳性对照Ct值|<7,判定为阳性结果，即样品掺 有鸡源性成分。
[0006] 基于本发明建立的Taqman-LNA荧光定量PCR检测方法，按下列步骤进行： 1)样品的制备与DNAfe；板的提取： 取肉制品25-30g，剪碎后，加去离子水制成1:4匀浆，吸取匀浆50yL于1.5mL离心管内， 按组织核酸提取(离心柱法)试剂盒使用说明操作，提取DNA备检。
[0007] 2)将试剂从冰箱取出后，置室温融化，8000 rpm离心10s。根据样品数按下表计算 试剂用量。
[0008] n=l (阴性对照)+1 (阳性对照)+样品数+损耗数 将上述Probes Master 2Xconc.，上、下游引物，探针和去离子水分别加入离心管中， 混勾后，8000 rpm离心10s。向设定的反应孔加入19yL/孔。
[0009] 3)加样： 将鸡肉DNA加入阳性对照孔、将去离子水加入阴性对照孔、将样品DNA分别加入样品反 应孔，1μ!7孔。用反应膜封住反应孔，置于荧光定量PCR仪上检测。
[0010] 4)反应参数设置：95°(：，8!1^11;95°(：，88,58°(：，258(采集焚光信号），35循环 ；40°(：， 10s〇
[0011] 5)结果判断： (1)质控标准 --阴性对照:无 Ct值或Ct值> 30，且无典型扩增曲线； 一一阳性对照：Ct彡20，且扩增曲线明显呈对数增长。
[0012] 阴性和阳性对照满足质控标准，实验有效，可进行结果判定。
[0013] (2)判定和报告 样品无 Ct值，或Ctcj^a)>30,或Icto^a)- CtOT? | >7,且样品无明显扩增曲线的，判为阴 性，报告样品不含鸡源性成分。
[0014] let(揣a- Ct侧?I <7,且扩增曲线明显呈对数增长，判为阳性，报告样品掺有鸡源 性成分。
[0015] let觸)-Ct纖)|>7，ct(獅)<30,且扩增曲线明显呈对数增长，判为假阳性，报告 样品污染鸡源性成分。
[0016] 本发明的优点以及有益效果是： 1.本发明提供的引物和锁核酸探针具有良好的检测灵敏度和特异性。
[0017] 2.本发明建立了用于快速检测肉制品中鸡源性成分掺假的Taqman-LNA荧光定量 PCR方法。该法提出以样品Ct值与阳性对照Ct值的绝对差值作为掺假成分阳性判定标准， 解决了生产加工和销售过程中肉污染造成的掺假误判和其他肉类非特异性反应造成的假 阳性。
[0018] 3.本发明为其他动物源性成分的检测探索了新的途径。
【附图说明】
[0019] 图1为鸡源性成分Taqman-LNA荧光定量PCR检测方法特异性试验扩增曲线图。
[0020] 其中图中1为鸡源性成分;2-11为牛、绵羊、山羊、猪、驴、鸭、鹅、火鸡、兔、虾源性 成分和阴性对照。
[0021 ]图2为鸡源性成分Taqman-LNA荧光定量PCR检测方法灵敏性扩增曲线图。
[0022]其中图中：1-6 的DNA 浓度分别为：183ng、18.3ng、1.83ng、0.183ng、0.0183ng、 0.00183ng ;7为阴性对照。
【具体实施方式】
[0023]以下实施例子是对本发明作进一步详述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。
[0024] 参考图1和图2，实施例1:特异性试验 检测设备:LightCycler ? 480型焚光定量PCR仪(Roche)，高速离心机(Beckman)，恒温 干热器（Eppendorf) 〇
[0025]检测试剂：核酸提取（离心柱法）试剂盒由达安公司提供，Probes Master 2X cone.由Roche公司提供，上、下游引物和锁核酸探针由上海辉睿公司合成标记。具体序列如 下： 上游引物序列为：5 ' -TAGCCCTAAATCTAGATACCTCCC -3 ' ； 下游引物序列为:5'_ ACCGCCAAGTCCTTAGAGTTT -3'； 锁核酸探针序列为：5'_ Hex-CACATGTATCCGC+CTGAGAACTACGA-BHQl -3'。
[0026]样品：牛、绵羊、山羊、猪、驴、鸡、鸭、鹳、火鸡、兔、奸肌肉。
[0027] 检测步骤： 1)样品的制备与DNAfe；板的提取： 取样品25g，加去离子水制成1:4匀浆，吸取匀浆50yL于1.5mL离心管内，按核酸提取(离 心柱法)试剂盒使用说明操作，提取DNA。经紫外分光光度计测定其纯度为1.81~2.11，DNA 浓度为107.38~183.11叫/^1^。其中鸡肉0财含量为183.11叫/^1^，00260/00280值为 2.01。将上述样品DNA稀释为50ng/yL后进行特异性试验。
[0028] 2)反应液配制。
[0029] 将试剂从冰箱取出后，置室温融化，8000 rpm离心lOsec。按下表计算试剂用量。
[0030] 将上述Probes Master 2 X cone.，上、下游引物，探针和去离子水分别加入1.5mL 离心管中，混勾后，8000 rpm离心10sec。分别加入96孔反应板，19yL/孔。
[0031] 3)加样： 将鸡肉DNA加入阳性对照孔、将去离子水加入阴性对照孔、将样品DNA分别加入样品反 应孔，1μL7孔。用反应膜封住反应孔，置于LightCycler? 480型荧光定量PCR仪上检测。 [0032] 4)反应参数设置:95°C8min;95°C，8s，59°C，25s(采集荧光信号），35循环。
[0033] 5)结果判断：（1)质控标准 --阴性对照:无 Ct值； 一一阳性对照：ct为17.8，且扩增曲线明显呈对数增长。
[0034]详见图1，阴性和阳性对照满足质控标准，实验有效，可进行结果判定。
[0035] (2)判定和报告 所有样品均无 Ct值，也无明显扩增曲线。均判定为阴性。报告牛、绵羊、山羊、猪、驴、鸭、 鹅、火鸡、兔、虾DNA不含鸡源性成分，即与鸡DNA无交叉反应。
[0036] 实施例2:敏感性试验 用去离子水10倍系列稀释纯鸡肉DNA，直至1〇Λ按实施例1进行Taqman-LNA荧光定量 PCR试验，每个稀释度作3个重复，并设去离子水阴性对照。结果如图2。由此可知其检测低限 达10-5，即鸡肉DNA浓度为0.00183ng/yL，相当于鸡肉含量0.001%。
【主权项】
1. 用于肉制品中鸡源性成分掺假快速鉴别的Taqman-LNA荧光定量PCR的引物序列和探 针序列，其特征是所述引物序列包括： 上游引物序列为：5 ' -TAGCCCTAAATCTAGATACCTCCC -3 ' ； 下游引物序列为:5'_ ACCGCCAAGTCCTTAGAGTTT-3' ； 所述锁核酸探针序列为： 5. Hex-CACATGTATCCGC+CTGAGAACTACGA-BHQl-3'。2. 用于肉制品中鸡源性成分掺假快速鉴别的Taqman-LNA荧光定量PCR的方法，其特征 在于包括如下步骤： (1) 设计引物和锁核酸探针的序列： 上游引物序列为：5 ' -TAGCCCTAAATCTAGATACCTCCC -3 ' ； 下游引物序列为:5'_ ACCGCCAAGTCCTTAGAGTTT-3' ； 所述锁核酸探针序列为： 5. Hex-CACATGTATCCGC+CTGAGAACTACGA-BHQl-3'； (2) 采用步骤（1)设计的引物和探针建立鸡源性成分掺假快速鉴别的Taqman-LNA荧光 定量PCR检测方法，其中包括： 荧光定量PCR检测的反应体系为:20yL，其中包括10yL Probes Master 2Xconc，其中 包含有dNTP，Mg2+以及Taq酶，步骤（1)中设计的1 Ομπιο 1 /L上下游引物F/R各0.3yL，1 Ομπιο 1 /L Taqman-LNA 探针P 0.1yL，DNA 模板lyL，去离子水补至20yL;反应参数：95°C，8min; 95°C， 8s，58°C，25s，采集荧光信号，35循环； 其中预变性时间取决于Taq酶;应用仪器自带分析软件对实验结果进行分析处理，试验 设纯鸡肉DNA阳性对照和去离子水空白对照，阳性对照Ct值彡20，空白对照无 Ct值或以值> 30，且无典型扩增曲线，则试验有效，可进行结果判定； 样品无 ct值，或ct (梆^ > 30，或I ct (梆a - ct侧? I > 7，且无明显扩增曲线的，判为阴性， 报告样品不含鸡源性成分；let(稱Ct侧?I <7,且扩增曲线明显呈对数增长，判为阳性， 报告样品中掺有鸡源性成分；let(稱Ct侧? I >7，ct〇m)<30,且扩增曲线明显呈对数增 长，判为假阳性，报告样品污染鸡源性成分。
【文档编号】C12Q1/68GK105986027SQ201510114022
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年3月16日
【发明人】许如苏, 刘中勇, 周广彪, 段建发, 魏霜, 陈冠武
【申请人】中华人民共和国汕头出入境检验检疫局