序列（登录 号:KC343503)的同源性达99%，由此确定重组质粒已成功构建。将该重组质粒作为标准品， 经分光光度计测定A260/A280比值为1.88,其浓度为124.化g/化，根据公式:标准质粒的拷 贝数=(质量数X 6.023 X 1023 )パ质粒碱基对数X660)，计算质粒拷贝数量约为4X l〇i〇copies/]iL。
[0038] (4)巧光定量PCR的建立和条件优化：参照TAKARA试剂盒说明书建立20化扩增体 系：PremiX Ex Taq (2 X ) 1 OyL，上、下游引物分别为（1 ΟμΜ) 0.4化，TaqMan探针（5μΜ) 0.祉L， R0X Ref erence Dye Π (50 X )0.2化，双蒸水7 .化L，模板1. OyL。反应程序为：95 °C预变性 30s;95°C变性5s，60°C退火延伸34s，共40个循环。对实时巧光定量PCR反应体系中各组分浓 度和退火延伸溫度进行优化，W获得最低的Ct值和较高的巧光强度增加值。
[0039] 巧光定量PCR引物和探针浓度筛选结果表明，采用ΙΟμΜ的引物浓度和扣Μ的探针浓 度进行检测时，可获得较高的巧光强度增加值和较小的Ct值。循环条件优化结果表明，60°C 为最佳退火溫度。
[0040] (5)标准曲线制作：将已知标准品质粒进行10倍倍比稀释，得到4 X107~4 X IQicopiesAiL系列标准模板，采用优化好的检测体系进行巧光定量PCR，得到各自的Ct值， Wet值为纵坐标，起始模板浓度的对数1巧为横坐标制作标准曲线y = -3.512X+40.24，y为 Ct值，X为IgX，如图1所示。
[0041] W10倍倍比稀释得到的4X107~4Xl〇icopiesAiL的重组质粒为标准模板，同时W 空质粒为阴性对照进行巧光定量PCR扩增。如图1所示，模板浓度与可检测到的巧光信号的 循环数负相关，相关系数R2 = 0.999表明不同梯度模板的对数值与Ct值之间呈现良好的线 性关系，可用于模板浓度的测定。扩增效率E = 92.76%，在80%~120%之间说明扩增效率 理想。
[0042] (6)特异性实验:根据上述检测体系对56株供试菌株(如表1所示)进行检测，通过 巧光定量PCR结果验证引物及探针的特异性。
[0043] 供试的25株扁桃拟茎点霉P.amygdali及3巧巾参试菌株(详见表1)在相同条件下进 行化qMan巧光定量PCR检测。如图2所示，选取的25株扁桃拟茎点霉均有明显的扩增曲线生 成，而所有的其他参试菌株及空白对照均无扩增。说明该化qMan巧光定量PCR法具有很好的 种属特异性。
[0044] (7)灵敏度实验：
[0045] 将标准品质粒进行10倍倍比稀释，得到4X 107~4X l〇icopiesAiL7个浓度后，对标 准品质粒各稀释度进行化qMan巧光定量PCR检测，同时将P. amygdal i基因组DNA进行10倍倍 比稀释，得到1 X 1 〇2~1 X 1 〇-4pg/化系列浓度，用引物对化-F2、化-R2 (如表2所示)进行常规 PCR，比较二者检测灵敏度的差异。结果显示所建立的巧光定量PCR最低可检测到4 X IQicopies(如图3所示，图3中各个曲线分别对应于7个浓度和一个NC空白样），相当于 0.1 fg/化的DNA能被检测到。常规PCR最低可检测到lOOfg/化，由此可见，所建立的巧光定量 PCR方法的灵敏度明显高于常规PCR，是常规PCR的1000倍。
[0046] P. amygdali在培养基上常会有分生抱子组成黄色粘液从分生抱子器器口泌出，取 该黄色粘液悬浮于无菌水中，采用血球计数板对抱子进行计数。将抱子悬浮液进行10X倍 比稀释，得到2 X 104~2 X lOMVyL 5个浓度后，对P.amygdali抱子各稀释梯度进行TaqMan 巧光定量PCR和常规PCR检测，比较二者检测灵敏度的差异（图5中各个曲线分别对应5个浓 度）。如图5所示，结果显示所建立的巧光定量PCR最低可检测到2Xl〇MVyL。常规PCR最低 可检测到2Xl〇i个AiL，由此可见，所建立的巧光定量PCR方法的灵敏度高于常规PCR，是常 规PCR的10倍。
[0047] 在同一个实验中，每个浓度重复3次W分析组内差异;在不同时间段进行3次实验， 同一次实验每个浓度重复3次，进行组间差异分析。根据获得的Ct值计算平均Ct值、标准差 (SD)和变异系数(CV)，来评价本方法的重复性。具体为：W 3个浓度梯度(4 X 107、4 X 105、4 X 103copiesAiL)的标准品质粒进行3次组内及3次组间重复测定。通过统计分析可知，组内重 复测定其CV值在0.3~0.8%之间，组间重复测定其CV值在0.4~0.6%之间（如表3所示），CV 值均小于1，说明本研究所建立的扁桃拟茎点霉化qMan巧光定量PCR检测方法的重复性和稳 定性良好。
[0048] (8)实际样品检测:利用分离培养法、常规PCR法和巧光定量PCR方法对田间采集的 50份样品进行检测，检验该巧光定量PCR方法的实用性。
[0049] 表3TaqMan巧光定量PCR重复性实验结果
[(K)加 ]
[0052] 表3中SD代表Standard Deviation(标准差），CV代表Coefficient of Variation (变异系数)。
[0053] 实施例2:实际样品检测
[0054] 利用分离培养法、常规PCR法和巧光定量PCR法对田间采集的50份样品进行检测。 结果显示，在化qMan巧光定量PCR中有43份样品呈现明显扩增曲线，检出率达86%;在常规 PCR中有39份为阳性，检出率达78% ;而培养法中只有36份成功分离出扁桃拟茎点霉，检出 率为72% (如表4所示），因此可认为巧光定量PCR检测样本的灵敏度高于培养法和常规PCR。 同时分离培养法实验周期长，整个检测过程需要72h，任务量大，且易受腐生菌的干扰造成 实验结果的偏差，不适用于样品的快速检测;常规PCR虽然在灵敏度和特异性方面较培养法 得到大幅提升，但检测效率仍低于巧光定量PCR。综上所述，TaqMan巧光定量PCR法不仅能特 异性的检测出扁桃拟茎点霉，检出率高，而且省时省力，可W运用到实际样品的检测中。
[0055] 表4分离培养法、常规PCR法和巧光定量PCR法对样品的检测
[0化6]
【主权项】
1. 一种扁桃拟茎点霉TaqMan荧光定量PCR引物，其特征是:所述引物包括SEQ ID N〇:l 所示的上游引物histone H3-F和SEQ ID No: 1所示的下游引物histone H3-R组成的引物 对。2. 用于检测扁桃拟茎点霉的探针，其特征是：包括SEQ ID No: 1所示的探针histone H3-P。3. 如权利要求2所述的探针，其特征是:所述探针histone H3-P的5'端标记荧光报告基 团FAM，3 '端标记荧光猝灭基团TAMRA。4. 一种检测扁桃拟茎点霉的方法，其特征是，包括以下步骤： (1) 合成上游引物histone H3-F、下游引物histone H3-R和探针histone H3-P，并对探 针histone H3-P进行标记； (2) 提取待检测样品的基因组DNA，以上游引物histone H3-F和下游引物histone H3-R 进行扩增，得到扩增产物； (3) 采用荧光定量PCR检测体系对待测样品进行检测。5. 如权利要求4所述的检测扁桃拟茎点霉的方法，其特征是:所述探针histone H3-P的 5 '端标记荧光报告基团FAM，3 '端标记荧光猝灭基团TAMRA。
【专利摘要】本发明涉及一种扁桃拟茎点霉TaqMan荧光定量PCR引物及探针，其特征是：所述引物包括SEQ？ID？No：1所示的上游引物histone？H3-F和SEQ？ID？No：1所示的下游引物histone？H3-R组成的引物对。所述用于检测扁桃拟茎点霉的探针，包括SEQ？ID？No：1所示的探针histone？H3-P。所述探针histone？H3-P的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光猝灭基团TAMRA。所述检测扁桃拟茎点霉的方法，其特征是，包括以下步骤：（1）合成上游引物histone？H3-F、下游引物histone？H3-R和探针histone？H3-P，并对探针histone？H3-P进行标记；（2）提取待检测样品的基因组DNA，以上游引物histone？H3-F和下游引物histone？H3-R进行扩增，得到扩增产物；（3）采用荧光定量PCR检测体系对待测样品进行检测。本发明适用于扁桃拟茎点霉Taqman荧光定量PCR检测，快速、灵敏、简便。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/04, C12Q1/68, C12R1/645
【公开号】CN105671196
【申请号】CN201610244771
【发明人】张华 , 胡白石
【申请人】中华人民共和国无锡出入境检验检疫局
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年4月19日