专利名称：一种快速鉴别文山三七与易混品屏边三七的pcr-rflp方法
技术领域：
本发明涉及物种分子鉴定技术领域，具体涉及限制性内切酶(MluC I和Nla IV)对云南省道地药材文山三七及其易混品屏边三七的分子鉴别技术。
背景技术：
文山三七是五加科人参植物三七(Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen)的干燥根，又名南国神草、田七，是我国重要的名贵中药材之一，明代著名的药学家李时珍将三七称为“金不换”。《本草纲目拾遗》中记载:“人参补气第一，三七补血第一，味同而功亦等，故称人参三七，为中药中之最珍贵者”。三七和人参(Panax ginseng C.A.Mey.)同为人参属植物，但三七活性物质种类比人参多，且含量高，因此被现代中药药物学家称为“参中之王”。现代医学实践证明，三七对心脑血管系统、神经系统、免疫系统、代谢系统疾病有不同程度的治疗功效，具有抗衰老、抗炎、抗肿瘤方面的药理作用。以三七为原料的药品有云南白药、片仔癀、三七冠心宁、血塞通、七叶神安片、地奥心血康、复方丹参滴丸、东北红药等。除作为药品外，三七也可用于生产保健品和化妆品。文山三七早已成为地理标志(证明商标)而中外著名，文山三七指云南省文山壮族苗族自治州所产的三七。三七栽培地道性要求严格，在文山壮族苗族自治州以外栽培，其品质和产量大为逊色。因此，文山三七除倍受我国国内制药行业喜爱外，还出口日本、新加坡、韩国、美国、英国、澳大利亚等国家，为我国出口创汇产生了较大的经济效益。在文山三七分布地区也有一些其他人参属植物，如屏边三七(P.stipuleanatusTsai et Feng)、竹节参(P.japonicus C.A.Meyer)等,其中屏边三七是现存野生资源最多的人参属植物，在云南省及其周边省份均有分布，市场上常将屏边三七作为文山三七销售。屏边三七的皂苷种类和含量均少于文山三七，因此，屏边三七代替或者混入文山三七中会影响药效。近年文山三七价格暴涨，出现了一些不法商人利用三七的同属和其他属植物的块根冒充文山三七的现象，特别是用屏边三七冒充文山三七(广州市药品检验所.中药材鉴别原色图谱.广州:广东科技出版社，1988，10;扬兆起等.中药鉴别手册(第三册).北京:科学技术出版社，1994，I)。人参属植物形态特征极为相似，仅根据干燥块根形状很难区别文山三七和屏边三七。因此，急需建立快速、可靠的分子鉴别方法。近年来，随着DNA分子技术的发展，基于PCR的DNA指纹图谱和测序技术已经成功地引用于中药材质量评价研究领域(曹晖等.DNA分子标记技术:一种新的中药分析方法，药物分析杂志，1999，19(5):355-360)。植物核rDNA的内转录间隔区(int ernal transcribed spacer, ITS)包含被5.8SrDNA所分隔的ITSl和ITS2两个片段，ITSl的长度为187 298bp，ITS2为187 252bp，PCR扩增及测序简单易行。ITS序列变异较快，可以提供较丰富的变异位点和信息位点，已经应用于许多被子植物科内、近缘属间及种间关系的研究。
发明内容
本发明针对文山三七原料真伪感官鉴别困难、易混入屏边三七等问题，提供一种可靠的文山三七与易混品屏边三七的分子鉴别方法。本发明所提供的一种快速鉴别文山三七与易混品屏边三七的PCR-RFLP方法，由待鉴别样本的总DNA提取、PCR扩增、PCR扩增产物纯化、酶切反应、琼脂糖凝胶电泳、分析鉴别步骤组成，所述的PCR扩增采用的引物是ITS引物，所述的ITS引物由正向引物和反向引物组成，所述的正向引物的碱基序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物的碱基序列如SEQ IDNO:2所示；PCR扩增产物纯化后，将纯化后的PCR扩增产物分成样品I和样品2两等份并均进行酶切反应，样品I中加入限制性内切酶MluC I，样品2中加入限制性内切酶Nla IV，两个酶切反应产物分别用2%琼脂糖凝胶电泳得MluC I酶切图谱和Nla IV酶切图谱，对酶切图谱进行分析，在MluC I酶切图谱中，如果样品I有三条带，大小分别约为450bp、200bp和lOObp，且在Nla IV酶切图谱中，如果样品2被切为两条带，大小分别约为500bp和lOObp，则待鉴别样本为文山三七；在組冗I酶切图谱中，如果样品I只有约450bp的一条带，且在Nla IV酶切图谱中，如果样品2不能被Nla IV酶切开，其电泳条带与用碱基序列如SEQ IDNO:1所示的正向引物和碱基序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物扩增的PCR扩增产物带大小一样，约为750bp，则待鉴别样本为屏边三七。本发明还提供MluC I酶和Nla IV酶在用PCR-RFLP方法鉴别文山三七与屏边三七中的应用。本发明的有意效果是:本发明通过用ITS引物对文山三七和屏边三七样品DNA的PCR扩增，经过大量实验首次筛选出MluC I酶、Nla IV酶酶切PCR扩增产物，MluC I酶切图谱中，文山三七有三条带，大小分别约为450bp、200bp和lOObp，而屏边三七只有约450bp的一条带，因此能够鉴别样品是否为文山三七；Nla IV酶切图谱中，屏边三七不能被Nla IV酶切开，其电泳条带与PCR扩增产物大小一样，在 750bp左右；而文山三七被切为两条带，大小分别为500bp和IOObp左右，因此能够鉴别样品中是否混有屏边三七。本发明首次成功建立了文山三七、屏边三七的限制性内切酶(Nla IV和MluC I)酶切图谱，可以准确鉴别文山三七和屏边三七。本发明克服了感官评审难以鉴别文山三七原料的真伪问题。采用本发明方法鉴定需要6-8h时间，达到了快速、准确鉴定的目的。
图1是PCR-RFLP方法鉴别文山三七与屏边三七的MluC I酶切图谱。图中，M:DL2000 DNA ladder ;1_3:文山三七叶片;4_5:文山三七根;6_10:屏边三七叶片;11_17:屏边三七根。图2是PCR-RFLP方法鉴别文山三七与屏边三七的Nla IV酶切图谱。图中，M: DL2000DNA ladder ；ck:引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的PCR扩增产物；1~2:屏边三七叶片；3-4:屏边三七根；5-9:文山三七叶片；10-13:文山三七根。
具体实施例方式本发明主要仪器:PCR仪(CFX Manager)、日立台式离心机、核酸蛋白分析仪(GeneQuant pro)、水浴锅、冰箱、电泳仪(DYY-6C)、凝胶成像分析系统(ImageQuant300)。以下操作无特别说明为常规方法。1.样本DNA的提取文山三七叶片和根采自云南省文山壮族苗族自治州苗乡三七科技示范园种植三年生植株；屏边三七叶片和根采自云南省文山壮族苗族自治州马关县古林箐乡文山三七科技示范园，分别取文山三七及屏边三七的叶片和根，分别提取DNA。DNA提取按照CTAB法(邹喻苹等编著。系统与进化植物学中的分子标记，提取总DNA见第16页)。文山三七叶片和根以及屏边三七叶片和根均可通过商业渠道购买到。2.1TS引物的设计ITS引物自行设计，合成于昆明硕阳科技有限公司。所述的ITS引物由正向引物和反向引物组成，所述的正向引物的碱基序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物的碱基序列如SEQ ID NO:2 所示。4.PCR 扩增60 μ L PCR 扩增反应体系:10 XPCR Buffer (含 Mg2+):6 μ L ；2.5mM dNTPs mixture(2.5mM each):4.8μ L ;引物(SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO: 2):各 2 μ L( IOD 引物溶入 400 μ LddH20 中)；10ng/y L基因组 DNA:3μ L ;ddH20:17.8μ L ;EasyTaq DNA polymerase3U0 PCR试剂购买于北京全式金生物技术有限公司。PCR 扩增用 2720Themal Cycler PCR 仪(Invitrogen, Applied Biosystems)进行。PCR扩增程序如下:94°C预变性5min，94°C变性lmin，51°C退火2min，72°C延伸2min，共30个循环，72°C延伸10min，4°C保存。5.PCR产物纯化将所得的PCR产物利用北京百泰克生物技术有限公司生产的多功能DNA纯化回收试剂盒进行纯化，操作步骤为:(I)每100 μ IPCR扩增体系加入500 μ I溶液/结合液DB，充分混匀。(PCR体系不足100 μ I者，用双蒸水调至100 μ I)。(2)将上步所得混合物溶液加入吸附柱AC中，室温放置2 3min，12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液。(3)加入700 μ I漂洗液WB (已加入无水乙醇)，12000rpm离心2min,弃掉废液。(4)加入500 μ I漂洗液WB12000rpm离心2min,弃掉废液。(5)吸附柱AC放回空收集管中12000rpm离心5min，尽量除去漂洗液。(6)取出吸附柱AC，放于一个干净离心管中，在吸附膜中间部位加入60μ I洗脱液EB (EB提前放于65-70°C水浴中加热)，室温放置2min，12000rpm离心2min。注:洗脱液EB分两次加入，每次30 μ I。6.限制性内切酶酶切反应上述样本纯化后的PCR产物均分成两等份，其中一等份进行MluC I酶切反应，另一等份进行Nla IV酶切反应。限制性内切酶MluC I和Nla IV购于美国New EnglandBiolabs公司，酶切反应按照产品说明书进行。MluC I酶切反应:15 μ I (包括10ΧΝΕΒ缓冲液1.5 μ 1，内切酶I μ 1，PCR纯化产物 12.5μ 1)，37°C温浴 3h。
Nla IV酶切反应:15 μ I (包括 10 XNEB 缓冲液 1.5 μ I，100 XBSA0.15 μ I，内切酶
Iμ 1，PCR 纯化产物 12.35μ 1)，37°C温浴 3h。7.琼脂糖凝胶电泳配2%琼脂糖凝胶，I XTAE缓冲液，电压120V，电流200mh，电泳Ih,将电泳图片放于凝胶成像分析系统拍照。8.数据处理和分析将电泳图片进行处理后，对比样本的酶切情况，通过酶切位点大小和位点数即可鉴定出样本。9.结果分析从图1MluC I酶切图谱可以看出，文山三七(泳道1-5)有三条带，大小分别约为450bp、200bp和lOObp，而屏边三七(泳道6-17)只有约450bp的一条带。文山三七的MluC I酶酶切条带与屏边三七的MluC I酶酶切条带明显不同，因此能够鉴别样品是否为文山三七。从图2NlaIV酶切图谱可以看出，屏边三七(泳道1-4)与对照(ck，引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的PCR扩增产物)相同，有750bp左右的一条带，说明屏边三七PCR产物不能被Nla IV酶切开；文山三七(泳道5-13)有两条带，第一条500bp左右，第二条IOObp左右，表明:屏边三七和文山三七的Nla IV酶酶切图谱完全不同，因此可以鉴别样品中是否混入了屏边三七。MluC I酶切图谱和Nla IV酶切`图谱清楚表明:在MluC I酶切图谱中，如果样品有三条带，大小分别约为450bp、200bp和IOObp，且在Nla IV酶切图谱中，如果相同样品被切为两条带，大小分别约为500bp和lOObp，则待鉴别样本为文山三七；在組冗I酶切图谱中，如果样品只有约450bp的一条带，且在Nla IV酶切图谱中，如果相同样品不能被Nla IV酶切开，其电泳条带与引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的PCR扩增产物(ck)带大小一样，约为750bp，则待鉴别样本为屏边三七。
权利要求
1.一种快速鉴别文山三七与易混品屏边三七的PCR-RFLP方法，由待鉴别样本的总DNA提取、PCR扩增、PCR扩增产物纯化、酶切反应、琼脂糖凝胶电泳、分析鉴别步骤组成，其特征在于:所述的PCR扩增采用的引物是ITS引物，所述的ITS引物由正向引物和反向引物组成，所述的正向引物的碱基序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物的碱基序列如SEQ ID NO:2所示；PCR扩增产物纯化后，将纯化的PCR扩增产物分成样品I和样品2两等份并均进行酶切反应,样品I中加入限制性内切酶MluC I，样品2中加入限制性内切酶Nla IV，两个酶切反应产物分别用2%琼脂糖凝胶电泳得MluC I酶切图谱和Nla IV酶切图谱，对酶切图谱进行分析，在MluC I酶切图谱中，如果样品I有三条带，大小分别约为450bp、200bp和IOObp，且在Nla IV酶切图谱中，如果样品2被切为两条带，大小分别约为500bp和IOObp，则待鉴别样本为文山三七；在組冗I酶切图谱中，如果样品I只有约450bp的一条带，且在Nla IV酶切图谱中，如果样品2不能被Nla IV酶切开，其电泳条带与用SEQ ID ΝΟ:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物扩增的PCR扩增产物带大小一样，约为750bp，则待鉴别样本为屏边三七。
2.MluC I酶和N la IV酶在用PCR-RFLP方法鉴别文山三七与屏边三七中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种快速鉴别文山三七与易混品屏边三七的PCR-RFLP方法，该方法的PCR扩增采用的引物是由ITS正向引物和反向引物组成，所述的正向引物的碱基序列如SEQ ID NO1所示，反向引物的碱基序列如SEQ ID NO2所示；PCR扩增产物纯化后，分别用限制性内切酶MluC Ⅰ、限制性内切酶Nla Ⅳ酶切，在MluC Ⅰ酶切图谱和NlaⅣ酶切图谱中，文山三七与屏边三七酶切图谱完全不同，可鉴别样品是否为文山三七、是否混入了屏边三七。本发明首次成功建立了文山三七、屏边三七的限制性内切酶酶切图谱，可以准确鉴别文山三七和屏边三七且快速，克服了感官评审难以鉴别文山三七原料的真伪问题。
文档编号C12Q1/68GK103173563SQ201310128370
公开日2013年6月26日 申请日期2013年4月15日 优先权日2013年4月15日
发明者张广辉, 杨生超, 杨云, 陈军文, 李翠婷, 陈中坚, 朱书生, 何霞红 申请人:云南农业大学