专利名称：一种酶固定化法生产右旋糖酐用的载体材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物酶法工艺中的一种材料，特别是固定化酶法工艺中的载体材料，确切地说是一种酶固定化法生产右旋糖酐用的载体材料。
背景技术：
右旋糖酐(Dextran)又名葡聚糖，是一种优良的血浆代用品，具有抗血栓、改善微循环等作用，并已广泛地应用于医疗、食品工业、生物学等领域。
右旋糖酐传统的生产工艺采用的是发酵技术，如章朝晖的“右旋糖酐的制备及应用”(《四川化工与腐蚀控制》2001，4(1)，50-52)，Mariana Santos等人在研究右旋糖酐生产时也用到了发酵技术(《Biochemical Engineering Journal》2000，(4)，177-188)。该工艺技术虽然较为成熟，但生产中乙醇消耗量大，生产环境恶劣，产品中的氮、氯等杂质或离子难以控制，分子量分布不均匀，后期分离、纯化比较困难，致使其产品质量较低。王勇等人在“右旋糖酐制取新工艺研究”(《生物技术》1994，4(3)，45-46)中采用了定向发酵技术来实现右旋糖酐分子量的分级处理，避免了使用盐酸降解，减少了氯离子等杂质，并降低了乙醇的使用量。但在生产过程中菌体与右旋糖酐相互缠绕，不能分开，致使产品中含有杂蛋白等杂质。CN1415631A公开的右旋糖酐生产工艺中采用了膜分离技术，该工艺尽管避免了酒精和一些有机溶剂的使用，但五级超滤膜过滤、分离处理，在工业生产中效率不高，且膜技术方法中存在着浓差极化及膜孔污染等一系列问题。右旋糖酐其它的分级、分离方法或技术，如Barker P.E.等人用色谱柱进行右旋糖酐分子量分级的研究(《Journal of Chemical Technology andBiotechnology》1989，46(3)，209-218)等，都只是对传统发酵生产工艺的某一步骤进行一些技术变化或处理，而不能做出本质的改进或提高。
CN1353193A公开的右旋糖酐生产工艺采用的是酶法技术。生物酶技术相对于传统的发酵技术而言，提高了右旋糖酐的产量，但用游离酶生产右旋糖酐，在生产过程中仍要使用盐酸，还是避免不了氯等杂质离子的引入，同时杂蛋白等一些杂质还是难以除去。Monsan等人在研究右旋糖酐生产时，考察比较了游离酶与固定化酶的酶活等一些特征(《Methods in Enzymology》1987，(136)，141-157)，固定化酶要优于游离酶。M.M.Abdel-Halim，El-Sayed等人在分批和补料分批生产右旋糖酐(《Biotechnologyand Bioengineering》1990，36(6)，338-345)以及在半连续分批补料生产右旋糖酐和右旋糖酐蔗糖酶(《Biotechnology and Bioengineering》1990，36(6)，346-351)的研究中是把肠膜明串珠菌固定在海藻酸钙上。N.V.Sankpal，A.P.Joshi等人在用固定化技术生产右旋糖酐的研究中，把根霉菌固定在多孔纤维素上(《ProcessBiochemistry》2001，37(4)，395-403)。用海藻酸盐充当固定化载体材料，凝胶母体的细孔易被右旋糖酐堵塞，降低了物质转运，且海藻酸盐的凝胶强度不高，固定化酶的海藻酸盐凝胶粒子容易破碎，使用周期较短，从而影响了右旋糖酐的最终产量和质量以及生产过程的控制。用多孔纤维素作固定化载体材料，克服了海藻酸盐的一些缺点，但固着率不高，右旋糖酐的最终产量及质量还是不理想。
工业化生产右旋糖酐，酶法优于发酵法，而固定化酶法又优于游离酶法。载体材料是影响固定化酶法工艺的重要因素。
发明内容
本发明为了避免上述各种生产方法及技术的缺陷，提高右旋糖酐的产量和质量，采用天然的和/或合成的水溶性或半水溶性的高分子与藻元酸和/或藻元酸盐构成的复合凝胶充当固定化载体材料来固定右旋糖酐蔗糖酶，并用来生产右旋糖酐。其特征在于，各组份有以下重量百分比藻元酸和/或藻元酸盐 75～99％天然水溶和/或半水溶性高分子 0～15％合成水溶和/或半水溶性高分子 0～10％两种高分子材料不同时为零。
优选配比藻元酸和/或藻元酸盐 60～95％天然水溶和/或半水溶性高分子 1～20％合成水溶和/或半水溶性高分子 1.5～20％。
较佳配比藻元酸和/或藻元酸盐 55～90％天然水溶和/或半水溶性高分子 4～25％合成水溶和/或半水溶性高分子 3～20％。
所述的天然水溶或半水溶性高分子材料包括明胶、壳聚糖及卡拉胶等。
所述的合成水溶或半水溶性高分子材料包括聚丙烯酸钠、聚甲基丙烯酸钠、聚乙烯醇和PVP等。
固定化及固定化酶反应操作过程如下取上述高分子复合载体材料加水配成2～10％浓度的凝胶溶液，向该凝胶溶液中加入一定量的细菌悬浮培养液并混匀，然后滴入氯化钙(CaCl2)溶液中形成滴丸，并让其交联成型1～2小时。分离，无菌水洗涤滴丸。该滴丸固着有经过悬浮培养的细菌。
在无菌条件下将滴丸接入诱导培养基中，恒温摇床培养，诱导生成生物酶。反应结束后过滤分离，用无菌水洗涤滴丸。该滴丸固着有右旋糖酐蔗糖酶，即固定化酶。
将固定化酶滴丸接入底物纯蔗糖溶液中进行酶转化反应生成高分子量的右旋糖酐。每一次酶转化反应后过滤分离，滴丸用无菌水洗净，再接入下一批底物重复使用。滤液经乙醇沉析得到右旋糖酐。
本发明从根本上避免了传统工艺和其它一些工艺技术在生产过程中所带来的氮、氯等杂质离子，降低了乙醇的使用量。同时，使用高分子复合凝胶材料充当固定化载体，酶固定化后的凝胶强度及作用效果大大增强，固定化酶及滴丸的可重复利用率提高，使用周期延长，右旋糖酐的产量及质量明显提高，有利于实际生产操作及生产过程的控制。本固定化酶技术为简便、快捷、高效生产右旋糖酐提供了有力的技术支撑。
与现有技术相比，本发明具有以下优点1、技术先进用培养分离出来的生物酶合成右旋糖酐，可消除生产过程中带来的氮、氯等杂质或离子。
2、生产成本降低运用固定化酶技术，可使生产过程连续化，而且酶可以重复利用，使生产成本显著降低。
3、产品质量提高，产量增加利用酶工程技术改造现有产业，使其技术升级换代，从而控制产品的杂质含量，使产品分子量分布均匀，质量提高。
具体实施例方式
(一)、高分子复合载体材料的配制1、取藻元酸或者藻元酸盐99份，明胶或PVP1份，混合均匀。
2、取藻元酸75份，明胶15份，聚丙烯酸钠10份，混合均匀。
3、取藻元酸盐60份，卡拉胶15份，明胶10份，聚丙烯酸钠10份，PVP5份，混合均匀。
4、取藻元酸50份，藻元酸盐40份，壳聚糖5份，聚乙烯醇5份，混合均匀。
5、取藻元酸30份，藻元酸盐25份，明胶10份，壳聚糖15份，聚甲基丙烯酸钠10份，PVP10份，混合均匀。
6、取藻元酸、藻元酸盐各40份，明胶、卡拉胶、壳聚糖、聚乙烯醇各5份，混合均匀。
7、取藻元酸、藻元酸盐各35份，明胶10份，聚乙烯醇9份，聚丙烯酸钠6份，PVP5份，混合均匀。
(二)、细菌的培养以肠膜明串珠菌为例。
取肠膜明串珠菌L.mesenteroides——1226经培养皿固体培养、液体悬浮培养。
培养基的配方液体培养基蔗糖≤20％、蛋白胨≤0.2％和Na2HPO4≤0.2％。
固体培养基蔗糖≤20％、蛋白胨≤0.2％、Na2HPO4≤0.2％和琼脂2％。
最后得细菌悬浮培养液备用。
(三)、酶固定取25ml的细菌悬浮培养液，加入75ml由(一)制备的载体材料加水配制的5％的凝胶溶液中混匀，然后滴入到CaCl2溶液中形成滴丸，并让其交联1～2小时。
将滴丸用无菌水洗净，在无菌条件下接入到酶诱导培养基上。在转速≤200rpm，温度20～30℃的恒温摇床上培养，诱导酶的生成。48小时后，将反应体系过滤，用无菌水冼涤滴丸，得到固定化酶。
酶诱导培养基蔗糖≤20％、蛋白胨≤0.2％、Na2HPO4≤0.2％、MnSO4·7H2O≤1％和CaCO3≤15％。
(四)、生产右旋糖酐将固定化酶滴丸接入含糖量小于15％的纯蔗糖溶液中，48小时后大量右旋糖酐生成。分离，滤液用95％乙醇沉析，沉析物即是右旋糖酐。固定化酶滴丸重复使用。
权利要求
1.一种酶固定化法生产右旋糖酐用的载体材料，其特征在于有以下组份和重量百分比藻元酸和/或藻元酸盐75～99％天然水溶和/或半水溶性高分子0～15％合成水溶和/或半水溶性高分子0～10％两种高分子材料不同时为零。
2.根据权利要求1所述的载体材料，其特征在于藻元酸和/或藻元酸盐60～95％天然水溶和/或半水溶性高分子1～20％合成水溶和/或半水溶性高分子1.5～20％。
3.根据权利要求1或2所述的载体材料，其特征在于藻元酸和/或藻元酸盐55～90％天然水溶和/或半水溶性高分子4～25％合成水溶和/或半水溶性高分子3～20％。
4.根据权利要求1所述的载体材料，其特征在于所述的天然水溶或半水溶性高分子包括明胶、壳聚糖、卡拉胶。
5.根据权利要求1所述的载体材料，其特征在于所述的合成水溶和/或半水溶性高分子包括聚丙烯酸钠、聚甲基丙烯酸钠、聚乙烯醇、PVP。
全文摘要
一种酶固定化法生产右旋糖酐用的载体材料，采用藻元酸或藻元酸盐同天然的和/或合成的水溶性或半水溶性高分子构成的复合高分子凝胶作固定化载体材料固定右旋糖酐蔗糖酶，并用来生产右旋糖酐。本载体材料强度大、固着牢、可重复使用，明显提高右旋糖酐的产量和质量，有利于工业生产过程控制。
文档编号C12N11/02GK1563374SQ20041001462
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月8日 优先权日2004年4月8日
发明者姚日生, 张洪斌, 何红波, 徐俊福, 鲁汉新, 朱慧霞 申请人:合肥工业大学, 江苏省黄海药业有限公司