羧基改性漂珠固定化漆酶及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于环境保护技术领域，具体涉及一种羧基改性漂珠固定化漆酶及其制备方法。
【背景技术】
[0002]漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是含有四个铜离子的多酚氧化酶，属于蓝色多铜氧化酶家族。漆酶主要分布在一些高等植物如漆树及一些真菌如白腐菌中，不同来源的漆酶结构上也不尽相同，因此其生物特性也有差异。漆酶能够降解多种酚类和芳胺类化合物，具有良好的底物专一性和稳定性，因而在废水处理、生物漂白和生物传感器构建等方面具有重要的应用前景。由于游离漆酶易溶于水，酶存活时间短，活性不稳定，使用后不易回收再利用，限制了其在实际生产中的应用。
[0003]酶的固定化技术是实现酶连续使用和改善酶稳定性的有效手段。固定化酶与游离酶相比具有很多优点，它能够延长酶的使用寿命，提高酶的稳定性及其对环境的适应性，因而能够克服直接使用游离酶的不足。
[0004]固定化漆酶是指将水溶性漆酶以物理或化学的方法固定在有机或无机的载体上，形成不溶于水的具有酶活性的酶衍生物。常用的载体有多孔玻璃、壳聚糖、硅藻盐和纤维素等。固定化漆酶的制备方法主要有吸附法、包埋法、共价键键合法和交联结合法。吸附法是指将酶液与石墨、碳纤维、过渡金属或其氧化物等活泼载体接触，使酶通过分子间相互作用力吸附在载体上的固定化方法。物理吸附的优点在于其操作简单、造价低廉、固定化酶初始活性较高，但固定化酶容易因酶和载体结合力不强，脱落而失活。包埋法是将漆酶物理包埋于高聚物网格内或微囊内的方法，一般反应条件温和，对酶自身的结构改变很少，因此酶活性损失较小，但包埋法处理的固定化酶仅适合于底物和产物均为小分子的催化反应，对有大分子参与的催化反应过程较差。交联法就是借助双功能团或多功能团试剂，使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构固定化酶的方法，由于交联法反应条件剧烈，单独使用交联法固定化漆酶的效果不佳。共价键键合法是指酶分子上的非活性官能团与载体上的活化基团反应，形成稳定的化学共价键的方法，使酶与载体形成牢固结合，不易发生酶的脱落，但共价键键和法存在反应条件较为苛刻，加工工艺较长，固定化效率较低的缺陷。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有方法的缺点，提供一种操作简单，条件温和的固定化漆酶及其制备方法，该固定化漆酶可以方便、高效率的去除水中的染料等有机污染物。
[0006]本发明的一种羧基改性漂珠固定化漆酶的制备方法，其特征按如下步骤实施:
[0007](I)胺基改性漂珠的制备:
[0008]粉煤灰漂珠经200目和250目的不锈钢筛子筛分，取粒径为200-250目之间的颗粒。放入2mol/L的盐酸溶液中浸泡洗涤60min，水洗去除酸液后，放入烘箱烘干，备用。取经过酸洗的漂珠放入异丙醇与去离子水的混合溶液中，搅拌形成悬浮液，在室温条件下滴加胺基硅烷的醇水溶液，滴加完毕后，继续反应12-24h。反应结束后，过滤分离得到的固体，用醇水混合溶液洗涤颗粒表面，去掉未反应的胺基硅烷，得到的固体即为胺基改性漂珠。
[0009](2)羧基改性漂珠的制备:
[0010]在烧瓶中加入N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)、胺基改性漂珠，向其中滴加马来酸酐的DMF溶液，滴加结束后，在室温下24-48h。反应结束后，过滤分离得到的固体，用DMF洗涤颗粒表面，去掉未反应的马来酸酐，得到的固体即为羧基改性漂珠。
[0011](3)羧基改性漂珠固定化漆酶的制备:
[0012]在烧瓶中加入0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH = 6.0)，羧基改性漂珠和漆酶溶液，在室温条件下搅拌吸附固化24-48h，反应结束后过滤分离，用缓冲液反复洗涤，直至上清液中检测不到蛋白质。得到的固体颗粒即为羧基改性漂珠固定化漆酶，保存于4°C的冰箱中备用。
[0013]上述所述(I)中胺基硅烷可以是γ-胺丙基三乙氧基硅烷、γ-胺丙基三甲氧基硅烷、Ν-(β-氨乙基)-γ-胺丙基三乙氧基硅烷、苯胺基甲基三乙氧基硅烷、苯胺基甲基三甲氧基硅烷中的一种或二种混合物。
[0014]上述所述⑴中漂珠与胺基硅烷的质量比为(8-2): I。
[0015]上述所述(2)中胺基改性漂珠与马来酸酐的质量比为1: (5-12)。
[0016]上述所述(3)中漆酶溶液为将漆酶溶解于0.lmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH = 6.0)，质量浓度为20g/L。
[0017]上述所述(3)中羧基改性漂珠与漆酶溶液的质量比为1: (2-10)。
[0018]本发明的羧基改性漂珠中含有大量游离的羧基官能团，羧基官能团能够与漆酶分子结构中的胺基形成静电结合，形成固定化漆酶，提高漆酶的稳定性和重复利用率，羧基改性漂珠固定化漆酶可以直接用于含有染料等有机废水中。由于漂珠具有良好的机械性能和漂浮性能，使用过程中适当的机械搅拌作用可形成悬浮体系，催化反应结束后，撤掉机械搅拌作用，固定化漆酶即可漂浮在溶液表层，极易进行机械分离。
[0019]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明。
【具体实施方式】
[0020]实施例1
[0021]粉煤灰漂珠经200目和250目的不锈钢筛子筛分，取粒径为200-250目之间的颗粒。将20g漂珠放入2mol/L的盐酸溶液10mL中浸泡洗涤60min，水洗去除酸液后，放入烘箱烘干，备用。取酸洗漂珠5g放入50mL异丙醇与去离子水的混合溶液(9: I)中，开启磁力搅拌，使之形成悬浮液。在室温条件下滴加1g质量浓度为10%的γ-胺丙基三乙基硅烷醇水溶液(异丙醇:去离子水=9: 1)，滴加完毕后，继续反应12h。反应结束后，过滤分离得到的固体，用醇水混合溶液洗涤颗粒表面3-5次，去掉未反应的胺基硅烷，得到的固体即为胺基改性漂珠。
[0022]在烧瓶中加入10mL DMF、5g胺基改性漂珠，向其中滴加28g马来酸酐的DMF溶液(5mol/L)，滴加结束后，在室温下24h。反应结束后，过滤分离得到的固体，用DMF洗涤颗粒表面，去掉未反应的马来酸酐，得到的固体即为羧基改性漂珠。
[0023]在烧瓶中加入0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH = 6.0)50mL，羧基改性漂珠5g、漆酶溶液25mL，在室温条件下搅拌反应24h，反应结束后过滤