的水型nadh氧化酶及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域中的NADH氧化酶，具体是一种可再生辅酶NAD+的水型 NADH氧化酶及其编码基因与应用，该氧化酶能够利用〇2作为底物将NADH氧化为NAD%同时 生成副产物&0。
【背景技术】
[0002] 随着氧化还原酶在生物催化制备手性醇、手性径酬、径基酸、氨基酸等方面显示越 来越重要的作用，在制药，食品，精细化工，农药等领域均表现出广泛的用途，对该类型的酶 的研究也成为当今研究的热点之一。但是氧化还原酶在反应过程中，需要消耗一定量辅酶， 大约80 %的氧化还原酶的辅酶为尼克酷胺腺嚷岭二核巧酸（NAD7NADH)，使得运类辅酶在 工业和科研上的需求随之剧增。然而，辅酶的价格是非常昂贵的，有时甚至比酶催化反应所 得到的产物的价格还要高，而其重复利用性和稳定性却很低。辅酶再生是实现氧化还原酶 催化反应的必需步骤，是关系到氧化还原酶工业化应用的关键。而对于很多氧化还原酶的 应用来讲，辅酶再生面临巨大的挑战。
[0003] 辅酶再生的方法主要有生物法、酶法、化学法、电化学法和光化学法。酶法原位再 生辅酶由于操作简单、效率高专一性强，而且可与其它酶兼容，受到人们的青睐。酶法再 生辅酶的方法中，应用于还原性辅酶（NAD(巧H)的再生已经比较成熟，如甲酸脱氨酶再生 NADH和葡萄糖脱氨酶再生NADPH。而氧化性辅酶（NAD任η的再生方法却很少，实现氧化 性辅酶的再生，对于在生物催化过程中生产难W制备的酬类化合物或对应体纯的醇类化合 物是非常关键的。目前应用比较多的方法主要有：醇脱氨酶还原丙酬生成异丙醇再生辅酶 NAD+;乳酸脱氨酶还原丙酬酸生成乳酸再生辅酶NAD谷氨酸脱氨酶还原α-酬戊二酸生成 谷氨酸使NAD+再生。但是运些方法仍然还难W满足工业化生产的需求，因为运些方法通常 需要加入辅底物，并有辅产物生成，使下游提取过程更加困难，生产成本也大大增加，有时 甚至会产生酶抑制现象影响反应效率。
[0004] 最近几年，通过NADH氧化酶再生辅酶逐渐得到了人们的重视，NADH氧化酶（NADH oxidase,Ν0Χ，EC1. 6. 99. 3)是一种黄素蛋白，在〇2存在条件下，该酶催化NADH氧化为NAD+ 的同时〇2还原为H2O或&〇2。根据〇2还原后产物的不同，N0X可分为两类：一类还原为H2O2， 反应过程产生2个电子的转移，称之为&〇2型NADH氧化酶；另一类还原为Η2〇,反应过程中 产生4个电子的转移，称之为&0型NADH氧化酶。&〇2型NADH氧化酶，由于产生的过氧化 氨对氧化还原酶有失活作用，而且在应用过程中需要加入过氧化氨酶分解电〇2,运样使得反 应体系更加复杂，因此在应用上该型酶受到一定限制。鉴于W上原因，电0型NADH氧化酶 的研究越来越受到人们的重视，因为它的产物为水，对反应体系基本没有多大影响，操作简 单且容易分离，可用于再生NAD+，具有广阔的应用前景，是非常有潜力的氧化态辅酶再生体 系之一。目前，国外已有不少关于不同来源的N0X的研究报道，但是能应用于工业化生产的 &0型NADH氧化酶还是比较少，所W挖掘开发更多新型高活性&0型NADH氧化酶是非常有 必要的，目前国内专口针对该类型酶的研究还比较少。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在提供一种可再生辅酶NAD+的水型NADH氧化酶及其编码基因与应用。
[0006] 本发明是通过W下技术方案实现的：可再生辅酶NAD+的水型NADH氧化酶，是如 SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列。
[0007] 上述水型NADH氧化酶的制备步骤为：
[0008]S1:将如沈QIDNO. 2所示的水型NADH氧化酶编码基因插入到质粒中得到重组表 达载体；
[0009]S2:将所述重组表达载体转移到宿主微生物中得到基因工程菌；
[0010]S3:培养所述基因工程菌得到重组NADH氧化酶，即本发明所述水型NADH氧化酶。
[0011] 上述水型NADH氧化酶来源于戊糖乳杆菌LactobacilluspentosusATCC8041。 所述水型NADH氧化酶具有如下酶学性质：(a)利用化作为底物，将NADH氧化为NAD%同时 生成副产物&0;化）最佳抑为5. 0~10. 0、最佳溫度为10~50°C情况下酶活最高；（C)通 过SDS-PAGE测定的分子量为45-55kDa;(d)酶活最大为124U/mg，Km为99μM，kcat/km为 62.6min1μΜ1; (e)与短乳杆菌L.breviDSM20054中获得的化Nox具有的64%氨基酸序 列同源性。
[0012] 另外，本发明提供了可再生辅酶NAD+的水型NADH氧化酶在甘油转化生成1，3-二 径基丙酬中的应用。
[0013] 针对该应用，所述甘油转化生成1,3-二径基丙酬的方法为：在水型NADH氧化酶、 甘油脱氨酶及辅酶存在下，底物甘油发生氧化反应生成1，3-二径基丙酬。其转化生成路线 如下：
[00141
[001引式中：glycerol指甘油；GlyDH指甘油脱氨酶；LpNox指水型NA畑氧化酶； 1, 3-dihy化oxyacetone指 1, 3-二径基丙酬值HA)。
[0016] 优选的，该方法是在抑为5. 0~10. 0的憐酸缓冲液中实现的；另外，所述的辅酶 为NADH及NAD+中的一种或两种W任意比例混合的混合物。还有，该方法的反应溫度为10~ 50 °C。
[0017] 具体应用时，所述水型NADH氧化酶在反应体系中的用量为l-20U/mL。所述辅酶的 加入量在反应体系中的用量为0. 002-2.OmM。
[0018] 采用本发明所述水型NADH氧化酶，可W利用该酶与甘油脱氨酶体外串联转化甘 油生成1，3-二径基丙酬，与化学方法制备1，3-二径基丙酬相比，该方法具有反应条件溫 和，对环境友好，操作简单，易于放大等优势。
【附图说明】
[0019] 图1为LpNox经蛋白纯化后聚丙締酷胺凝胶电泳结果。
[0020] 图2为LpNox最佳抑研究结果示意图。
[0021] 图3为LpNox最适催化溫度的研究结果示意图。
[0022] 图4为LpNox溫度稳定性的研究结果示意图。
[0023] 图5为LpNox与甘油脱氨酶体外串联转化甘油生成1，3-二径基丙酬的时间进程 示意图。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合附图，给出本发明的较佳实施例，并予W详细描述。
[00巧]SanPr巧柱式PCR产物纯化试剂盒（SK8141)购于生工生物工程（上海）股份有 限公司。SanPr巧柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（SK8192)购于生工生物工程（上海）股 份有限公司；PCR扩增试剂dNTP，Buffer,Taq酶购于生工生物工程（上海）股份有限公司； 限制性内切酶BamHiahoI购于Takara;连接酶和ligationbuffer购于SCIENTIFIC;PCR 引物购于生工生物工程（上海）股份有限公司；DM上样缓冲液，DM标准分子量Marker购 于生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白双染色Marker购于生工生物工程（上海）股 份有限公司。
[0026] 下列实施中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
[0027] 1.在本发明的下述实施例中，使用的大肠杆菌培养基配制方法如下：
[0028] (1)LB培养基
[002引1L的LB液体培养基中加入10.Og化C1，10.Og膜蛋白腺，5.Og酵母浸粉，定容到1L后，用抑计检测其抑，一般显碱性，然后用5mol/L的化0H慢慢调节抑至7.0。若是配 置固体培养基，可在配好的液体培养基的基础上，按1. 5%的含量加入琼脂粉。密封好后，用 高压蒸汽灭菌锅在12rC下，灭菌30min，待冷却后放在4°C低溫冰箱中保存待用。
[0030] 似TB培养基
[0031] 将下列组分溶解在0.化水中：膜蛋白腺12g，酵母提取物24g，甘油4mL。将各组 分溶解后高压灭菌。冷却到60°C，再加入lOOmL灭过菌的憐酸缓冲液（2. 31g的KH2PO4和 12. 54g的K2HPO4溶于100血水中。）。
[0032] 2. 1，3-二径基丙酬含量的检测方法：
[0033] 取反应液液50μL加水稀释至500μL取稀释液离屯、后的上清液50μL加入二 苯胺溶液450μL，沸水浴加热14min，流水冷却。W二苯胺溶液为空白，于608皿处测吸光 度，根据标准曲线计算反应液中产物1，3-二径基丙酬的含量。
[0034] 实验例1NADH氧化酶基因的筛选和分析
[0035] 通过对NCBI基因数据库进行筛选和分析，确定在戊糖乳杆菌Lactobacillus pentosusATCC8041基因组中与短乳杆菌NADH氧化酶具有较高同源性的蛋白基因序列为 候选研究对象，基因序列SEQIDNO. 2所示。
[0036] 实验例2重组表达载体祀T28a-LpNox和祀T28a-GlyDH构建
[0037] 根据基因序列（LpNox基因及GlyDH基因）设计引物，LpNox基因上游引物为CG CGGATCCATGAAAGTTATCGTAATTGGTTGTACTCAT,下游引物为CCGCTCGAGTTATTCCGTCACTTTTTC AGCCGC;GlyDH基因上游引物为CGCGGATCCATGGACCGCATTATTCAATCACCGG，下游引物为 CCGCTCGAGTTATTCCCACTCTTGCAGGAAACGC，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合 成。下划线部分为BamHI和化〇1酶切位点。再W戊糖乳杆菌基因组和大肠杆菌基因组为模 板PCR扩增得到LpNox基因和GlyDH基因，琼脂糖凝胶电泳结果表明扩增得到的基因大小 与理论值一致。将回收的LpNox基因，GlyDH基因和祀T28a，用限制性内切酶BamHI和化〇1 在37°C水浴中酶切2小时，经纯化回收的目的片段与质粒在T4连接酶的作用下室溫过夜连 接，得到重组表达载体祀T28a-LpNox和祀T28a-GlyDH。将重组表达载体转化至大肠杆菌 BL21 (DE3)的感受态细胞中，在含有卡纳抗性的平