一种cik细胞的诱导培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体的说是设及一种CIK细胞的诱导培养方法。
【背景技术】
[0002] CIK细胞（巧tokinein化cedkiller,细胞因子诱导的杀伤细胞）是一种新型 的免疫活性细胞，它是自体外周血单个核细胞，经多种细胞因子共同诱导培养产生的一类 CD3+和CD56+两种膜蛋白分子共同表达的杀伤细胞。CIK细胞具有抗肿瘤活性和非MHC杀 瘤特性，是一种具有增殖速度快，杀瘤活性高，杀瘤谱广等特点的效应细胞。
[0003] 现有诱导培养CIK细胞的方法一般为从外周血分离得到的单个核细胞（PBMC)在 白介素-2(比-2)等细胞因子的作用下在37°C、5%二氧化碳的条件下直接诱导成CIK细胞。 但是运种方法诱导培养的CIK细胞中含有数量较多的CD4+CD25+调节性T细胞。
[0004] 1995年Sakaguchi发现成年鼠中近10%的外周CD4巧细胞表达IL-2受体α链 CD25。去除运群细胞会引起小鼠自发产生多种自身免疫性疾病而回输该细胞则阻止疾病的 发生。因此将运群细胞命名为CD4+CD25+调节性Τ细胞Treg。 阳0化]调节性T细胞灯reg)是抑制性T细胞的一种功能亚群，天然的化eg细胞于1995 年由Sakafguchi等首次报道，他们约占外周血CD4巧细胞数的5% -10%左右。
[0006] 调节性Treg细胞分为两类：天然Treg细胞和获得性Treg细胞，目前认为天然 Treg细胞来自于胸腺，主要通过细胞接触抑制发挥抑制功能；获得性Treg细胞是外周血成 熟T细胞在持续抗原的刺激和细胞因子条件下诱导产生，主要通过TGF-β、比-10等可溶性 细胞因子发挥作用。
[0007] 近年来，许多学者对Treg细胞在肿瘤免疫方面大量的研究证实，肝癌、肺癌、卵巢 癌、胃肠道肿瘤、乳腺癌、急慢性淋己细胞白血病、恶性淋己瘤、鼻咽癌等患者外周血或肿瘤 局部Treg细胞成分显著增加。在对结直肠癌的研究中发现进展期癌较早期癌患者外周血 调节性T细胞显著增加。在对肝癌的研究中发现，肝癌组织较旁组织Treg细胞明显增加， 运些分布方式说明，在肿瘤组织中的Treg由于与效应细胞T淋己细胞的紧密接触，抑制效 应细胞的功能，从而发挥肿瘤免疫作用。因此，为了使免疫细胞治疗，如CIK细胞治疗，发挥 最大的免疫作用，故寻求一种降低CD4+CD25+调节性T细胞数量的CIK诱导培养方法非常 必要。
【发明内容】
[0008] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种CIK细胞的诱导培养方法，使得所述方法 能够显著降低CIK细胞中CD4+CD25+调节性T细胞数量。
[0009] 本发明的另一个目的在于提供一种CIK细胞的诱导培养方法，使得所述方法显著 提高诱导培养出的CIK细胞中的效应细胞数量。
[0010] 本发明的另一个目的在于提供一种CIK细胞的诱导培养方法，使得所述方法显著 提高诱导培养出的CIK细胞的杀伤活性。
[0011] 本发明的另一个目的在于提供一种CIK细胞的诱导培养方法，使得所述方法提高 诱导培养出的CIK细胞分泌TGF-β和IL-10的能力。
[0012] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0013] 一种CIK细胞的诱导培养方法，包括：
[0014] 步骤1、用抗CD8抗体包被细胞培养容器；
[0015] 步骤2、将单个核细胞用免疫细胞培养基重悬并接种在步骤1包被好的容器中，添 加IFN-λ细胞因子于39°C下进行细胞培养；
[0016] 步骤3、培养后去掉培养基并再次加入新鲜的免疫细胞培养基重悬，并转移至新的 容器中，添加IFN-λ、比-1α、0KT-3W及比-2细胞因子诱导培养CIK细胞，定期补充新鲜 培养基和IL-2细胞因子。
[0017] 针对现有CIK细胞诱导培养方法诱导的细胞中CD4+CD25+调节性Τ细胞数量较 高、效应细胞较少、杀伤活性不高W及分泌TGF-β和IL-10能力不高的一系列问题，本发明 在前期将单个核细胞培养在抗CD8抗体包被的容器中，并添加适当的细胞因子和提高细胞 培养溫度，而后期培养添加多种适宜细胞因子进行CIK细胞的诱导培养，才能够多个措施 入手降低CD4+CD25+调节性Τ细胞数量。
[0018] 其中，作为优选，所述单个核细胞采用Ficoll分离液运用S巧mate离屯、管从外周 血分离获得。除此之外，本领域技术人员也可参照已公开的单个核细胞分离方法。
[0019] 作为优选，步骤2所述IFN-λ细胞因子的浓度为500-1500U/I止，具体可W选择 500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400 或 1500U/mL。
[0020] 作为优选，所述免疫细胞培养基为X-VIV0 15培养基。
[0021] 作为优选，所述单个核细胞接种W5Xl〇5-10X1〇5个/ml的细胞密度接种。
[0022] 作为优选，步骤3所述各细胞因子浓度为500-1500U/mLIFN-λ、50-150U/mL的 比-Ια、10-50ng/ml的ΟΚΤ-3W及lOO-lOOOU/ml的比-2。其中，IFN-λ具体可W选择 500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400或 1500U/mL;IL-1α具体可W选择50、 75、100、125 或 150U/mL;0ΚΤ-3 具体可W选择 10、20、30、40 或 50ng/ml;比-2 具体可W选择 100、200、300、400、500、550、600、700、800、900 或lOOOU/ml。
[0023] 作为优选，步骤3所述诱导培养细胞为在37°C、5%二氧化碳的环境中培养14天。
[0024] 作为优选，步骤2所述培养为在39°C、5%二氧化碳的环境中培养12-2地。 阳0巧]作为优选，所述细胞培养容器为细胞培养瓶，例如T75细胞培养瓶等。 阳0%] 按照本发明方法诱导培养的CIK细胞其CD4+CD25+调节性T细胞数量为3.6%， 而现有的诱导培养方法中CD4+CD25+调节性T细胞数量为6. 7%，明显得到降低，从而降低 了CIK细胞中CD4+CD25+调节性T细胞的免疫抑制作用。同时，本发明诱导的CIK细胞中 效应细胞数量为34. 3%，而现有的诱导培养方法中效应细胞的数量为20.8%，显著提高效 应细胞的数量。
[0027] 此外，本发明还对所诱导的CIK细胞进行了杀伤活性检测W及TGF-β和IL-10含 量检测，虽然本发明改变了诱导培养方法，但是CIK细胞的杀伤活性和分泌TGF-β和IL-10 含量并未受到影响，且高于现有的CIK细胞的诱导培养方法。
[0028] 由W上技术方案可知，本发明增加单个核细胞在抗CD8抗体中培养的环节，并 调整诱导培养环节中细胞因子的加入，从多个方面整体控制诱导培养的过程，抑制了 CD4+CD25+调节性Τ细胞的产生，降低了其数量进而降低了其免疫抑制作用，使CIK细胞治 疗发挥最大的免疫作用。
【附图说明】
[0029] 图1所示本发明所述方法诱导培养14天后CIK细胞的镜检图；
[0030] 图2所示为CIK细胞效应细胞W及CD4+CD25+调节性T细胞的流式检测结果；其 中A为本发明诱导的CIK细胞CD4+CD25+调节性T细胞的流式检测图，B为现有方法诱导 的CIK细胞CD4+CD25+调节性T细胞的流式检测图，C为本发明诱导的CIK细胞效应细胞 的流式检测图，D为现有方法诱导的CIK细胞效应细胞的流式检测图；
[0031] 图3所示为TGF-β标准品的吸光度值曲线；
[0032] 图4所示为比-10标准品的吸光度值曲线。
【具体实施方式】
[0033] 本发明实施例公开了一种CIK细胞的诱导培养方法。本领域技术人员可W借鉴本 文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术 人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例 进行了描述，相关人员明显能在不脱离本【发明内