别是10μg/ml，20μg/ml，30μg/ml、40μg/ml 及50μg/ml;从已恢复到室溫的密封袋中取出实验所需板条；
[0080] 留空白孔，提前30min制备生物素化抗体工作液，于10°C~35°C下避光放置； 阳0川分别将实验品或不同浓度的标准品（0μg/ml孔加试剂稀释液）加入相应孔中， 100μ1/孔，用封板胶纸封住反应孔，37°C解箱解育90min; 阳0間洗板4次；
[0083] 除空白孔外，加入酶结合物工作液，100μ1/孔。用胶纸封住反应孔，于37°C解箱 避光解育60min;
[0084] 洗板4次；
[00化]除空白孔外，加入酶结合物工作液，100μ1/孔。用胶纸封住反应孔，于37°C解箱 避光解育30min;
[0086] 洗板4次；
[0087] 加入显色底物，100μ1/孔，于37°C解箱避光解育15min; 阳08引加入终止液，100μ1/孔，混匀后检测其吸光度值（0〇45。值）。
[0089] 标准品吸光度值曲线分别参见图3和图4,实施例1和实施例2中细胞培养液所测 TGF-β的0〇45。值分别为1. 22和1. 02，根据TGF-β标准品的吸光度值曲线，可知TGF-β标 准品的浓度与吸光度值成线性关系，其先线性曲线为：Υ= 0. 047Χ+0. 29,根据曲线图，从而 可计算出本发明和现有技术的中的TGF-β的含量分别为19. 78μg/ml和15. 53μg/ml。
[0090] 实施例1和实施例2中细胞培养液所测IL-10的0〇45。值分别为1. 386和1. 054， 根据IL-2标准品的吸光度值曲线，可知IL-10标准品的浓度与吸光度值成线性关系，其先 线性曲线为：Y= 0. 11X+0.8,根据曲线图，从而可计算出本发明和现有技术的中的IL-10的 含量分别为 11. 31μg/ml和8. 426μg/ml。
[00川此外，将实施例3-实施例5的细胞培养液进行同样的检测，结果显示，TGF-β含 量均高于18μg/ml，比-10的含量均高于10μg/ml。表明本发明方法诱导出的CIK细胞分 泌TGF-β的能力和分泌IL-2的能力更高。
[0092] 实施例8:CIK细胞的杀伤活性检测
[0093] 本实施例中使用的细胞裂解液为9 %TritonX-100,购自PR0MEGA;底物液为 SunstrateMix,购自PR0MEGA;终止液为 1Maceticacid。
[0094] 1)铺板时各实验孔和对照设置如下： 阳0巧]实验孔：按效祀比40:1、20:1和10:1进行祀细胞化562)和效应细胞（CIK细胞） 的铺板。其中，CIK细胞的浓度分别为4Xl〇6/mL，2Xl〇6/mL，1Xl〇6/mU每孔100μL，每组 3个复孔；Κ562浓度为1XlOVmL，每孔100μL，每组3个复孔。
[0096] 效应细胞自然释放孔：4X106/mL，2X106/mL，lX106/mレ每孔100μレ每组3个复 孔，每孔加入100μL培养基。
[0097] 祀细胞最大释放孔：1XlOVmL的祀细胞，每孔100μL每组3个复孔，每孔加入 100μL培养基，于37°C、5 %二氧化碳培养箱解育前45min每孔加入20μL细胞裂解液。 阳09引祀细胞自然释放孔：1XlOVmL的祀细胞，每孔100μ以每组3个复孔，每孔加入100μL培养基。
[0099] 培养液空白对照海孔200μL培养液，每组3个复孔。
[0100] 体积纠正对照：每孔200μL培养液，每组3个复孔，于37°C、5%二氧化碳培养箱 解育前45min每孔加入20μL细胞裂解液。 阳1〇U2)铺板后将培养板250g离屯、4min，置于37°C、5%二氧化碳培养箱解育地。在培 养结束前45min，取出培养板，在祀细胞最大释放组和体积纠正组每孔加入20μL细胞裂解 液，250g离屯、4min，继续培养45min后取出。
[0102] 3)进行LDH(乳酸脱氨酶）测定，具体步骤如下：250g离屯、4min，每孔吸出50μL 上清转移到另一新的96孔板中，每孔加底物溶液50μ以室溫避光解育30min。每孔加入 50μL终止液，用振荡器将色素颗粒打散，测定490波长处的吸光度值。 阳103] 4)试验组、祀细胞LDH自然释放组和效应细胞LDH自然释放组的吸光度均值减去 培养液空白对照组吸光度值均值，获得校正值。祀细胞LDH最大释放组的吸光度均值减去 体积纠正组吸光度值均值，获得校正值。 阳104] 杀伤活性按如下公式计算： 阳105]活性=(Α-Ε-Τ)X100%
[0106] A:试验组吸光度值校正值； 阳107]E:效应细胞自然释放孔吸光度值校正值；
[0108] T :祀细胞自然释放孔吸光度值校正值； 阳109] Tm。、:祀细胞最大释放组吸光度值校正值。
[0110] 结果见表1。 阳111] 表1 CIK细胞对K562细胞的杀伤活性检测 阳112]
阳113]由表1可知，在杀伤K562时，本发明方法诱导的CIK细胞比现有方法诱导的CIK细胞的杀伤效果更好，差异较明显。
[0114] W上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核屯、思想。应当指出，对 于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发明进行 若干改进和修饰，运些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 一种CIK细胞的诱导培养方法，其特征在于，包括： 步骤1、用抗CD8抗体包被细胞培养容器； 步骤2、将单个核细胞用免疫细胞培养基重悬并接种在步骤1包被好的容器中，添加IFN-λ细胞因子于39°C下进行细胞培养； 步骤3、培养后去掉培养基并再次加入新鲜的免疫细胞培养基重悬，并转移至新的容器 中，添加IFN-λ、IL-1α、0KT-3以及IL-2细胞因子诱导培养CIK细胞，定期补充新鲜培养 基和IL-2细胞因子。2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述单个核细胞采用Ficoll分离液运用 sepmate离心管从外周血分离获得。3. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2所述IFN-λ细胞因子的浓度为 500-1500U/mL〇4. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述单个核细胞接种以5X10 5-10X105个/ ml的细胞密度接种。5. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述免疫细胞培养基为X-VIV0 15培养基。6. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3所述各细胞因子浓度为500-1500U/ mLIFN-λ、50-150U/mL的IL-1a、10-50ng/ml的 0KT-3 以及 100-1000U/ml的IL-2。7. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3所述诱导培养CIK细胞为在37°C、5 % 二氧化碳的环境中培养14天。8. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2所述培养为在39°C、5%二氧化碳的 环境中培养12_24h。9. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述细胞培养容器为细胞培养瓶。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，公开了一种CIK细胞的诱导培养方法。所述方法用抗CD8抗体包被细胞培养容器；将单个核细胞接种在包被好的容器中，并添加IFN-λ细胞因子于39℃下进行细胞培养；培养后去掉培养基并再次加入新鲜的培养基重悬，并转移至新的容器中，添加IFN-λ、IL-1α、OKT-3以及IL-2细胞因子诱导培养CIK细胞，定期补充新鲜培养基和IL-2细胞因子。本发明增加单个核细胞在抗CD8抗体中培养的环节，并调整诱导培养环节中细胞因子的加入，从多个方面整体控制诱导培养的过程，抑制了CD4+CD25+调节性T细胞的产生，降低了其数量进而降低了其免疫抑制作用，使CIK细胞治疗发挥最大的免疫作用。
【IPC分类】C12N5/0783
【公开号】CN105331581
【申请号】CN201510894815
【发明人】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 罗二梅, 张维敏
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年12月7日