增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子ccl5表达方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及间充质干细胞，特别是设及一种增强间充质干细胞趋化能力和趋化因 子CCL5表达的方法。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞（mesenchymalstemcells)是一类具有多向分化潜能的成体干细 胞，具有免疫调节，损伤修复，能够分泌多种活性因子，祀向损伤、肿瘤等部位；是研究和治 疗组织损伤，抑制免疫等疾病的理想材料和工具。
[0003] 趋化因子（chemokine)是指对于炎性细胞具有趋化作用的一类小分子蛋白，根据 其分子结构中4个位点上的半脫氨酸残基的分布W及附近氨基酸残基的结构分为CXC，CC， C和CX3C4 种类度a化willFR.TheJournalofpathology，2012;226(2):148-157)。趋 化因子CCL5是CC家族成员，具有诱导细胞趋药性的因子，它不仅有炎症和免疫监督的功 能，在肿瘤发展过程中也起到重要的作用（AldinucciDandColombattiA.Mediatorsof inflammation, 2014 :2014:292376)。从原发性的肿瘤部位、转移的肿瘤部位或者募集到 肿瘤的正常细胞分泌的趋化因子可W促进肿瘤的转移和血管生成，或者诱导形成免疫微环 境。CCL5能够诱导白细胞向炎症部位浸润，参与多种炎症反应；CCL5在很多疾病的病理生 理过程中起着重要的作用，如糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、器官移植排斥、人类免 疫缺陷病等。CCL5的基础和临床研究对治疗运些疾病有着重要的作用。然而，从天然组织 中分离CCL5有限，难W满足对其生物学功能研究和临床应用的需要，因此提高CCL5的表达 有利于对CCL5进行深入的基础和临床研究。
[0004] 间充质干细胞具有分泌包括成纤维细胞生长因子化FGF)、肝细胞生长因子 化GF)、人表皮生长因子巧GF)、血管内皮生长因子（VEGF)、趋化因子5(CCL5)、白细胞介素 6(比-6)等在内的多种细胞因子的潜能；在正常培养的条件下，多种细胞因子表现为低表 达，比如ID0、CCL5 ;当炎症环境等因素刺激时，运些细胞因子表达迅速升高。将在组织工 程、免疫性疾病治疗等领域有着重要的临床研究意义。而MSCs能够通过炎症因子的联合刺 激启动信号通路级联反应，最终调控本身的免疫因子的分泌，促进迁移能力，增强了其趋化 性能。
【发明内容】
阳0化]本发明的目的在于提供可提升间充质干细胞的免疫调节效果，增强其表达和分泌CCL5的能力，促进迁移能力的一种增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子CCL5表达的方 法。
[0006] 本发明包括W下步骤：
[0007] 1)厮带间充质干细胞的分离及原代培养；
[0008] 2)厮带间充质干细胞的传代；
[0009] 3)厮带间充质干细胞的鉴定；
[0010] 4)TNF-α和IFN- 丫对hUC-MSCs的刺激； 阳0川 5)Real-TimePCR检测(XL5的表达； 阳01引 6化LISA检测CCL5的表达。
[0013] 在步骤1)中，所述厮带间充质干细胞的分离及原代培养的具体方法可为：
[0014] 取婴儿厮带组织，浸泡于MSC培养基MSCM(stemcell公司），在超净台内用PBS清 洗残留的血液，去除厮静脉、厮动脉及厮带外膜，剥离Wharton胶，剪碎成1~2mm3大小的组 织块；将组织块放移至0. 1 %II型胶原酶中，加入少许MSCM，在37°C恒溫振荡仪内消化，直 至Wharton胶全部消化（消化过夜）；将含有细胞的消化液吸入无菌离屯、管，W30倍体积 的MSCM吹打细胞，用2000r/min离屯、lOmin，弃上清液；用添加有10%胎牛血清的α-MEM 培养基重悬细胞，接种到培养瓶中，置于5%二氧化碳细胞培养箱中进行培养。细胞贴壁后， 第五天首次换液，弃去未贴壁的细胞，W后每3~4天换液一次。
[0015] 在步骤2)中，所述厮带间充质干细胞的传代的具体方法可为：
[0016] 待细胞培养至80 %融合，用含有0. 25%邸TA的膜蛋白酶溶液消化细胞，重悬细 胞，然后接种到新的培养皿中，传代细胞。待细胞长至90%融合后，进行下一次传代培养。
[0017] 在步骤3)中，所述厮带间充质干细胞的鉴定的具体方法可为：
[0018] 采用流式细胞术检测CD29、CD34、CD44、CD45、CD90 ;同时进行成脂肪细胞和成骨 细胞的诱导鉴定。
[0019] 在步骤4)中，所述TNF-α和IFN- 丫对hUC-MSCs的刺激
[0020] 用含有TNF-a和IFN-丫的α-ΜΗΜ的培养基培养hUC-MSCs12h。所述的TNF-a 和IFN-丫的浓度分别为20ng/ml、50ng/ml;细胞生长的培养基只含有青霉素和氯霉素体积 百分比为1%，胎牛血清的体积百分数为1%。
[0021] 在步骤5)中，所述Real-TimePCR检测（XL5的表达的具体方法可为：
[0022] hUC-MSCs经炎症因子TNF-α和IFN- 丫刺激化后，提取总RNA进行反转录，同时 W未加处理的hUC-MSCs作为对照试验，进行Real-TimePCR实验，检测CCL5的转录情况；
[0023] ①6孔板每孔加入1mlTrizol，迅速吹打混匀至通亮，转到1. 5mlRNase化ee的 EP管中，静置5min，使核蛋白体分解；
[0024] ②每1mlTrizol加入0.2ml氯仿，用力摇晃15s，静置5min; 阳0巧]③12000g离屯、15min，离屯、后分3层，RNA存在于上层水样层中，大约为所加Trizol容量的 60%;
[00%] ④将上层转移至试管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，静置lOmin;12000g离 屯、lOmin，RNA成胶片状沉淀附着于管底；
[0027] ⑥移去上层液体，用75%乙醇1ml(-20°C预冷，用DEPC水配）洗涂RNA沉淀一次； 满旋振荡混合样品在4°C、7500g，离屯、5min ;
[0028] ⑧弃去上清，空气干燥5~lOmin(不能完全干燥），溶于20μLDEPC水中；
[0029] ⑦用核酸定量仪测定RNA的浓度；
[0030] ⑨用W上提取的总RNA作为模板，采用Takara的反转录试剂盒进行反转录，反转 录体系参见表1; W川表1 [0032]
[0033]x:lygRNA的体积。
[0034] ⑨按表2配制PCR反应混合液，并分至各反应管，然后加入2μL模板（DM模板的 添加量为50μg)。
[0035]表2
[0036]
[0037] 其中Real-time PCR引物的序列如表3所示；
[0038]表 3
[0039]
[0040] 在步骤6)中，所述化ISA检测CCL5的表达的具体方法可为： 阳〇川 hUC-MSCs经炎症因子TNF-α和IFN- 丫刺激1化后，吸去培养基，用憐酸缓冲液 PBS洗涂两次，然后添加无血清的细胞培养基，24h后取上清，进行化ISA检测(XL5的表达。
[0042] 本发明将人厮带间充质干细胞培养，长至80%~90%融合是传代，取第6~12代 的细胞，用含有炎症因子TNF-a和IFN-丫的培养液进行培养，最后进行实验组和对照组的 (XL5 的real-timePCR和ELISA的对比检测。
[0043] 本发明的有益效果：
[0044] (1)本发明使MSCs表达CCL5提高了924倍，能够获取大量天然的CCL5,相对于真 核表达，不需要脂质体转染，便捷快速。 W45] 似本发明中，TNF-α和IFN-丫的刺激，提升了间充质干细胞的迁移能力，提示间 充质干细胞能够在体内更迅速的募集到组织损伤及炎症部位，发挥组织修复和免疫调节功 能。
【附图说明】
[0046] 图1为MSCs的流式鉴定仰29); W47] 图2为MSCs的流式鉴定（CD34); W48] 图3为MSCs的流式鉴定（CD44); W例图4为MSCs的流式鉴定（CD45); W加]图5为MSCs的流式鉴定（CD90);
[0051] 图6为MSCs的诱导分化鉴定；
[0052] 图7为(XL5在实验组MSCs和对照组MSCs中的mRNA转录水平对比；
[0053] 图8为(XL5在实验组MSCs和对照组MSCs中的分泌水平对比；
[0054] 图9为实验组MSCs和对照组MSCs体外趋化性实验结果对比。
【具体实施方式】
[0055] W下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
[0056] (1)厮带间充质干细胞的分离及原代培养
[0057] 取婴儿厮带组织，浸泡于MSCs培养基MSCM(stemcell公司），在超净台内用PBS 清洗残留的血液，去除厮静脉、厮动脉及厮带外膜，剥离Wharton胶，剪碎成1~2mm3大小的 组织块；将组织块放移至0. 1 %II型胶原酶中，加入少许MSCM，在37°C恒溫振荡仪内消化过 夜，直至Wharton胶全部消化；将含有细胞的消化液吸入无菌离屯、管，W30倍体积的MSCM 吹打细胞，用2000以111111离屯、10111111，弃上清液；用添加有10%胎牛血清的-161培养基重悬 细胞，接种到培养瓶中，置于5 %二氧化碳细胞培养箱中进行培养。细胞贴壁后，第五天首次 换液，弃去未贴壁的细胞，W后每3~4天换液一次。 阳〇5引 似厮带间充质干细胞的传代
[0059] 待细胞培养至80%融合时，用含有0. 25%邸TA的膜蛋白酶溶液消化细胞，重悬细 胞，然后接种到新的培养皿中，传代细胞。待细胞长至90%融合后，进行下一次传代培养。
[0060] 厮带间充质干细胞的鉴定方法如下：
[0061] 采用流式细胞术检测CD29、CD34、CD44、CD45、CD90 ;同时进行成脂肪细胞和成骨 细胞的诱导鉴定。
[0062] ①流式鉴定细胞表面marker:培养MSCs细胞，长至融合状态；收集MSCs,用膜酶 消化后重悬，成1. 0X106/ml的单细胞悬液，每个流式管取0. 1ml;分别加入巧光标记抗体 CD29-門TC、CD44-門TC、CD90-門TC、CD45-門TC、IgGl、IgG2b，室溫避光解育 15min;PBS洗去 未结合的抗体，然后加入100μL的PBS重悬细胞；上机检测，检测前要用200目的尼龙膜过 滤。CD44