一种重组螺旋藻超氧化物歧化酶制备工艺的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种制备超氧化物歧化酶的方法，尤其是一种利用基因重组技术制备 纯顶螺旋藻超氧化物歧化酶的方法。
【背景技术】
[0002] 超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase，SOD)是一种源于生命体的活性物质和 抗衰老的金属酶，其本质是蛋白质，最早于1969年被美国科学家McCord和化idovich从牛 红血球中发现并提取出。在正常的新陈代谢过程中，机体会产生自由基，如果不能及时清除 就会对细胞产生毒害作用，而SOD能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，使细胞内超 氧化物自由基转化为氧和过氧化氨，从而达到平衡体内氧自由基的目的，按SOD结合的金 属离子不同，可W分为化-S0D、Mn-S0D和Cu/Zn-SOD。因SOD能平衡机体的氧自由基，有效 预防活性氧对生物体的毒害作用，因而具有抗福射、抗肿瘤及延缓机体衰老等功能，在保健 品、医药和化妆品行业中有重要的应用价值。
[0003] 目前生产SOD的方法有Ξ种：第一种是传统的从动物血中提取SOD。因世界各地 疯牛病、流感等各种传染病不断暴发与流行，从动物血液中提取SOD存在极大的安全隐患。 欧洲已从1999年颁布禁令：禁止动物血提取SOD长期用于人类。第二种是从植物中提取 S0D，由于植物体内SOD含量太低，很难实现产业化。第Ξ种是利用现代生物技术生产基因 重组人源S0D，运是国际生产SOD的最前沿技术。基因重组人源SOD具有无外源性污染、无 病毒残存、无免疫排斥、无蛋白种属差异、无过敏反应、纯度高、活性高，从根本上解决了人 类使用的安全问题。美国、日本、西欧一些国家早就开发重组人SOD药物，已进入到II期、 III期临床研究。在美国1992年SOD基因工程产品产值已达20亿美元。我国目前有二十 几家公司生产S0D，都是从牛、猪等动物血中提S0D，年产量3000亿U左右。吉林四平华科 生物技术有限责任公司是国内首家应用基因工程生产基因重组人源SOD的厂家，年产重组 人源SOD活力300亿U。
[0004] 螺旋藻中存在化-SOD而不含其他类型的S0D，故从螺旋藻中分离纯化化-SOD最为 理想。目前从螺旋藻中提取SOD还主要依靠理化技术，主要设及冷冻、超声波破碎、硫酸锭 分级沉淀、离子交换层析、凝胶过滤和浓缩等步骤。此生产工艺存在着有机溶剂残留、提取 程序复杂、产品成本高、生产周期较长，产率不高、纯度较低、产品安全性差等一些缺点。可 见，如何减少纯化步骤，降低成本，获得高比活力的SOD是生产SOD的关键问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种重组螺旋藻超氧化物歧 化酶制备工艺。
[0006] 为了实现本发明的目的，我们将采用如下技术方案予W实施：
[0007] -种重组螺旋藻超氧化物歧化酶，其特征在于所述的重组螺旋藻超氧化物歧化酶 基因序列的核巧酸序列和相应的氨基酸序列为：
[0008]SLEHHHHHH-
[0009] -种重组螺旋藻超氧化物歧化酶制备工艺，其特征在于：所述的制备工艺步骤如 下：
[0010] 一、螺旋藻基因组DNA的提取
[0011] (1)、用双蒸水将新鲜纯顶螺旋藻5000g离屯、5min共洗3次；
[0012] (2)、在预先经冷冻处理的研鉢中将280mg新鲜纯顶螺旋藻与少量灭菌的石英砂 混合，充分研磨；
[0013](3)、按植物基因组DNA提取试剂盒说明书的步骤进行提取基因组DNA;
[0014](4)、提取的基因组DNA洗脱于50μ1洗脱液TE中；
[001引 巧）、洗脱后的基因组DNA在-20°c溫度下保存备用。
[0016] 二、sod基因片段的扩增
[0017](1)、根据GenBank中登录的AY282414螺旋藻sod基因序列设计扩增引 物：上游引物SPS0DF:5 ' -ACATATGGCTTTTGAACTTCCCAG-3 ';下游引物SPS0DR: 5' -GCTCGAGGCTGGCAGACGCGAGA-3 '，引物对预期扩增片段长 614bp;
[0018] (2)、PCR扩增sod基因，W所提取螺旋藻基因组DM为模板，利用上述引物对扩增 sod基因，PCR反应条件为：94°C预变性3min，-94°C变性45s，-55 °C退火45s，72 °C延伸45s， 共30个循环，然后，72 °C再延伸6min;
[001引 （3)、取5μ1PCR产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳分析。
[0020]Ξ、sod基因片段的克隆
[002。 （1)、将45μ1PCR扩增产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳分离，用琼脂糖凝胶DNA回收 试剂盒切胶回收目的基因片段，回收产物用40μ1洗脱缓冲液邸洗脱，具体操作按琼脂糖 凝胶DNA回收试剂盒说明书进行；
[002引 似、将3μ1纯化的PCR产物和1μ1克隆载体pGEM-TfesyVector在40C连接过 夜；
[0023] (3)、将5μ1连接产物热激转化100μΙ感受态大肠杆菌D册α并涂布于含有 50μg/ml氨节青霉素的LB琼脂平板上，置37°C过夜培养；
[0024] (4)、次日，用无菌牙签挑取白色菌落接种于含Amp的LB液体培养基中，37°C摇床 培养过夜；
[00巧]巧）、用普通质粒小提试剂盒提取质粒。WSPS0DF和SPS0DR为引物对提取质粒的 插入片段进行扩增鉴定，同时用EcoRI对所提取质粒进行酶切鉴定；
[0026] 化）、将经PCR、酶切鉴定均正确的质粒进行测序；
[0027](7)、测序结果用NCBI中的Blast软件分析。
[0028] 四、sod基因原核表达载体的构建
[0029](1)、将测序正确的重组质粒pGEM-T-sod和重组质粒祀T30a-apcα(本实验室构 建的纯顶螺旋藻别藻蓝蛋白α亚基基因原核表达载体）分别用NdeI和化0I于37°C双 酶切地，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒切胶分别回收sod基因插入片段和线性化祀T30a载 体；
[0030] 似、使用DNALigationKit中的SolutionI，将sod基因插入片段与线性化 pET30aVectorDNA连接；
[003。 （3)、用连接产物热转化感受态大肠杆菌JM109中，并涂布在含有50μg/ml卡那霉 素的LB琼脂平板上，37 °C过夜培养；
[003引 （4)、挑取单菌落过夜培养并提取质粒，使用引物T7t对所提质粒测序。
[0033] 五、重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
[0034](1)、用测序正确的重组质粒祀T30a-sod转化化21 (DE3)感受态细胞，获得阳性表 达菌株；
[0035](2)、将100μ1重组表达菌株接种在10ml含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基 中37°C、220rpm振荡培养过夜，获得种子液；
[0036] (3)、取部分步骤（2)所述的种子液无菌条件下加甘油至30%，分装-70°C保存，备 用；
[0037] (4)、将步骤似所述的1ml种子液接种于100ml含50μg/血卡那霉素的2XYT液 体培养基中，在37°C、230rpm振荡条件下培养3.化，取出培养瓶，从培养物中无菌取样1ml， 留作空白对照；
[003引 巧）、然后向培养瓶中加入终浓度为0. 40mM的IPTG，调节培养溫度至31°C，230巧m 振荡培养化；
[0039]化）、取诱导前及诱导后菌液各0. 5ml，4°C，9000g离屯、lOmin，弃上清，沉淀重悬于 100μ1PBS中，加入25μ1 5XSDS-PAGE上样缓冲液，100°C热处理3min后，取10μ1进行 12%SDS-PAGE电泳分析。
[0040] 六、重组螺旋藻SOD发酵罐发酵
[0041] (1)、发酵种子的准备
[0042] ①、取所述的步骤五-(3)-70°C甘油菌100μΙ接种于5mlLB化arO培养基中， 37°C，220r/min过夜活化培养1她；
[0043]②、将5ml培养物转接于150mlTB化arO培养基中37°C，220r/min过夜培养20h， 获得发酵种子。
[0044] (2)、发酵罐准备
[0045] ①、将抑电极在蒸馈水中水化化W上，然后依次利用抑6.86和抑4. 0的缓冲液 完成电极的零点标定和斜率标定；
[0046] ②、在步骤①进行的同时将溶氧电极浸入蒸馈水中通电极化化W上，后浸入饱和 亚硫酸钢溶液内完成零点标定；
[0047] ③、卸掉发酵罐电机，将抑电极、溶氧电极装回罐内盛有2. 25LTB基础培养基的 发酵罐；
[0048] ④、将发酵罐连同补料瓶、补酸瓶、补碱瓶、250ml憐酸钟缓冲液及其管路于12rC 灭菌20min;
[0049] ⑥、灭菌后依次组装发酵罐的所有电路及管路系统。
[0050] (3)、发酵
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