051] ①、打开上位机和空气压缩机，W火焰接种法从接种口依次加入250ml憐酸钟缓 冲液、2ml消泡剂（Antifoam204SIGMA)和 2mlkan+(50mg/ml);
[0052]②、在上位机上设定如下培养条件：溫度37°C，通气量2(K)L/h，抑7. 0,转速50化/ min,在此状态下标定DO电极的100%值。
[0053] ③、适度调节气压，从取料口留取50ml培养基作为对照。
[0054] ④、停止揽拌和通气，向罐内无菌接入150ml种子液，调节通气量为2(K)LA，转速 50化/min,然后点击发酵开始，保存本批次发酵记录。
[00巧]⑥、通过取料口取10ml培养基作为化对照。
[0056] ⑧、发酵过程中通过调节通气量和转速使DO保持在30%左右，将溫度设置为自动 控制；
[0057] ⑦、通过自动滴加补酸液化4M肥1)和补碱液（4. 18M氨水）调节抑值；
[0058] ⑨、当发酵至化左右时，培养基中碳源耗尽溶氧值迅速上升，开始向罐内连续滴 加补料液400ml;补料过程中通过调节补料液的滴加速度、转速和通气量，尽量使DO保持在 20%左右，此过程中转速一般保持在7(K)r/min左右；
[0059]⑨、当发酵至1化从接种口无菌加入1. 25mlIPTG化2g/ml)，至IPTG终浓度为 0. 4mM，调节溫度为31°C，共诱导化；
[0060] ⑩、发酵过程中每小时取样10ml，用于细菌生长动态监测；发酵结束时，降低通气 量和转速，点击发酵结束，保存数据。将发酵液转入无菌Ξ角瓶中，关闭气源。
[0061](4)、细菌生长动态及蛋白表达效果监测
[0062] ①、用TB培养基调零，测定发酵过程中每小时所留菌液在600nm处的吸光度 孤抑0;
[006引②、取10ml菌液，4°C，9400Xg离屯、lOmin，弃上清，用棉签吸干残余液体，称量菌 体湿重（WCW)。
[0064] ③、目的蛋白表达效果用SDS-PAGE分析，取诱导前及发酵结束菌液各1. 5ml，离屯、 弃上清；
[0065] ④、沉淀重悬于0.SmlPBS中，超声波裂解，裂解条件为：功率400W，工作4S，停6S， 共约25个循环。裂解液14000Xg离屯、lOmin，取50ul上清液进行SDS-PAGE检测。
[0066] 巧)、发酵产物保存
[0067]将发酵液置4°C静置过夜后轻轻弃上清，沉淀于4°C，4000g离屯、20min，弃上清，收 集菌泥，W每份约lOg置-20°c保存备用。
[006引屯、重组螺旋藻SOD的纯化 [006引 （1)、重组菌裂解
[0070] ①、将4~8g重组菌沉淀充分重悬于80ml-非变性结合缓冲液中；
[0071] ②、连接好纳米高压均质机气路系统，打开空气压缩机；
[0072] ③、用约100ml蒸馈水清洗均质机；
[0073] ④、将待裂解细菌悬液加入进样桶内，15000psi压力裂解细菌3轮至裂解液透亮；
[0074] ⑥、将裂解液置58°C水浴加热处理lOmin后，于9400Xg，-4°C离屯、30min，0. 45μm 滤器过滤除去细胞碎片，滤液可直接上柱。
[007引 似、柱纯化
[0076] ①、取45ml空层析柱1支，用Ni-NTAAgarose树脂填满；
[0077] ②、将柱子用约150ml蒸馈水淋洗后用约150ml非变性结合缓冲液平衡；
[0078] ③、将处理好的细菌裂解液通过蠕动累滴入柱中，上样过程中若核酸蛋白检测仪 读数上升较大，则收集流出液一管；
[0079] ④、用约200ml非变性淋洗缓冲液洗涂柱子至吸光值近本底且不再降低；
[0080] ⑥、过程中需收集吸光值上升、峰值、下降期流出液至少各1管；
[0081] ⑧、用低抑洗脱液洗脱柱子，当吸光值上升至约0. 080时开始收集洗脱液，至吸光 值下降至0. 080W下后停止收集；
[0082] ⑦、纯化后用约200ml蒸馈水淋洗柱子；
[008引⑨、用SDS-PAGE检测蛋白纯化效果；
[0084] 八、进行SDS-PAGE、蛋白浓度测定、酶活性测定、纯酶分子量确定、NBT染色、金属 离子测定、热稳定性分析、酸碱稳定性分析。
[0085] 进一步，所述的步骤一中所述的上游引物SPS0DF:5'-ACATATGGCTTTTGAACTTCCC AG-3'中下划线部分为NdeI酶切位点；下游引物SPS0DR:5'-GCTCGAGGCTGGCAGACGCGA GA-3'，中下划线部分为化0I酶切位点。
[0086] 进一步，所述的步骤四中的LB琼脂平板上在临用前表面均匀涂布200mg/mlIPTG 7μ1,20mg/mlX-Gal28μ1〇
[0087] 进一步，所述的步骤六一（3)-⑨所述的补料液每400ml含酵母提取物12. 5g，甘油 240ml。
[0088] 进一步，所述的步骤屯中所述的非变性结合缓冲液：50mMNaH2P〇4,〇.5M化C1， 0. 1MKC1，lOmM咪挫，抑7. 4;非变性淋洗缓冲液：50mM化&?0"0. 5MNaCl，0. 1MKCl，20mM 咪挫，抑7. 4;低抑洗脱液：50mM化&?0"0. 5MNaCl，0.IMKCl，抑4. 5.
[008引有益效果
[0090]W纯顶螺旋藻为研究对象，克隆螺旋藻超氧化物歧化酶（SOD)的编码基因sod,构 建原核表达载体祀T30a-sod，并在大肠杆菌化2UDE3)里表达重组SOD;建立重组菌的发酵 罐发酵工艺和重组蛋白的纯化工艺；测定重组螺旋藻SOD的蛋白浓度和比活性；通过非变 性凝胶电泳分析重组螺旋藻SOD的天然分子量，利用氯化硝基四氮挫蓝液（NBT)染色法结 合等离子发射光谱仪测定纯酶所含金属元素确定重组螺旋藻SOD的种类；通过不同溫度热 处理和不同抑溶液解育纯酶液，确定纯酶的稳定性。通过W上各步工艺，最终建立一条完 善的重组螺旋藻SOD生产工艺，为后续开发基于重组螺旋藻SOD的药品、食品和化妆品等相 关产品奠定基础。
【附图说明】
[0091]图1为重组螺旋藻超氧化物歧化酶制备技术路线图；
[0092] 图2为sod基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析；
[009引 图3为重组质粒pGEM-T-sod化d1/化0I双酶切电泳图；
[0094] 图4为线性化载体祀T30a电泳图；
[0095] 图5为祀T-30a-sod的开放阅读框及其编码的氨基酸序列；
[0096] 图6sod基因在大肠杆菌化21 0E3)中的表达产物电泳图；
[0097] 图7为发酵过程中重组细菌生长曲线；
[009引 图8重组菌发酵产物SDS-PAGE电泳图；
[0099] 图9为重组SOD纯化产物电泳图；
[0100] 图10为重组SOD非变性凝胶电泳NBT染色；
[0101] 图11为60°c时SOD的活性变化；
[0102] 图12为65°C时SOD的活性变化；
[0103] 图13为抑值对SOD活性的影响；
【具体实施方式】
[0104] 结合附图对本发明做进一步地说明：
[0105] 如图1所示，本研究W鄂尔多斯高原碱湖纯顶螺旋藻为实验材料，通过克隆表达 其SOD的编码基因，并建立大规模重组SOD的发酵与纯化工艺，在此基础上深入分析重组表 达产物的生物学特性。
[0106] 鄂尔多斯高原碱湖纯顶螺旋藻，由鄂尔多斯高原沙地碱湖拱取纯化，用Zarrouk 培养液于室溫下培养，由内蒙古农业大学乔辰教授惠赠。感受态大肠杆菌D册α为Biomed 公司产品，感受态大肠杆菌JM109、化21 (DE3)为TaKaRa公司产品。
[0107] 螺旋藻sod基因原核表达载体的构建与表达 [010引螺旋藻基因组DNA的提取
[0109] 采用植物基因组DNA提取试剂盒提取螺旋藻的基因组DNA。用双蒸水将新鲜螺旋 藻5000Xg离屯、5min共洗3次。在预先经冷冻处理的研鉢中将280mg新鲜螺旋藻与少量 灭菌的石英砂混合，充分研磨。其余步骤按说明书进行。所提取基因组DNA洗脱于50μ1 洗脱液ΤΕ中。-20°C保存备用。
[0110] sod基因片段的扩增
[0111] 根据GenBank中登录的螺旋藻sod基因序列（AY282414)设计扩增引物。上游引物 SPS0DF:5' -ACATATGGCTTTTGAACTTCCCAG-3'(下划线部分为NdeI酶切位点）；下游引物 SPS0DR:5' -GCTCGAGGCTGGCAGACGCGAGA-3'，（下划线部分为化〇I酶切位点），引物对预 期扩增片段长614bp。委托Invitrogen公司合成。W所提取螺旋藻基因组DNA为模板，利 用上述引物对扩增sod基因。PCR反应条件为：94°C预变性3min，-94°C变性45s，-55