°C退 火45s，-72°C延伸45s，共30个循环，然后，72°C再延伸6min。取5μ1PCR产物进行1.5% 琼脂糖凝胶电泳分析。
[011引sod基因片段的克隆
[011引将45μ1PCR扩增产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试齐U盒切胶回收目的基因片段，回收产物用40μ1洗脱缓冲液邸洗脱。具体操作按试剂盒说明 书进行。将3μ1纯化的PCR产物和1μ1克隆载体pGEM-TEasyVector在4°C连接过夜。 将5μ1连接产物热激转化100μ1感受态大肠杆菌D册α并涂布于含有50μg/ml氨节青 霉素（Amp)的LB琼脂平板上（临用前表面均匀涂布200mg/mlIPTG7yl，20mg/mlX-Gal 28μ1)，置37°C过夜培养。次日，用无菌牙签挑取白色菌落接种于含Amp的LB液体培养基 中，37°C摇床培养过夜。用普通质粒小提试剂盒提取质粒。WSPS0DF和SPS0DR为引物对对 提取质粒的插入片段进行鉴定，同时用EcoRI对所提取质粒进行酶切鉴定。将经PCR、酶切 鉴定均正确的质粒送宝生物工程（大连）有限公司进行测序。测序结果用NCBI中的Blast 软件分析。
[0114]sod基因原核表达载体的构建
[0115] 将测序正确的重组质粒pGEM-T-sod和重组质粒祀T30a-apcα分别用NdeI和 化οI于37°C双酶切4h，用琼脂糖凝胶DM回收试剂盒切胶分别回收sod基因插入片段和 线性化祀T30a载体。使用DNALigationKit中的SolutionI，将sod基因插入片段与线 性化祀T30aVectorDNA连接。用连接产物热转化感受态大肠杆菌JM109中，并涂布在含 有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，37 °C过夜培养。挑取单菌落过夜培养并提取质粒， 使用引物T7t对所提质粒测序。
[0116] 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
[0117] 用测序正确的重组质粒祀T30a-sod转化化21 (DE3)感受态细胞，获得阳性表达菌 株。将100μ1重组表达菌株接种在10ml含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中37°C、 22化pm振荡培养过夜，获得种子液。取部分种子液无菌条件下加甘油至30%，分装-70°C 保存。将1ml种子液接种于100ml含50μg/mL卡那霉素的2XYT液体培养基中。37°C、 23化pm振荡培养3.化。取出培养瓶，从培养物中无菌取样1ml，留作空白对照。然后向培养 瓶中加入终浓度为0. 40mM的IPTG，调节培养溫度至31°C，230巧m振荡培养化。取诱导前 及诱导后菌液各0.5ml，4°C，9000Xg离屯、10min，弃上清，沉淀重悬于100μlPBS中，加入 25μ1 5XSDS-PAGE上样缓冲液，100°C热处理3min后，取10μ1进行12%SDS-PAGE电泳 分析。
[0118] 重组螺旋藻SOD发酵罐发酵工艺的建立 [011引发酵种子的准备
[0120] 取-70°C甘油菌lOOul接种于5mlLB化arO培养基中，37°C，220r/min过夜活化 培养1她。将5ml培养物转接于150naTB(kar〇培养基中37°C，220r/min过夜培养20h，获 得发酵种子。
[0121] 发酵罐准备
[0122] 将抑电极在蒸馈水中水化化W上，然后依次利用抑6. 86和抑4. 0的缓冲液完成 电极的零点标定和斜率标定。同时将溶氧电极浸入蒸馈水中通电极化化W上，后浸入饱和 亚硫酸钢溶液内完成零点标定。卸掉发酵罐电机，将抑电极、溶氧电极装回罐内盛有2. 25L TB基础培养基的发酵罐。将发酵罐连同补料瓶、补酸瓶、补碱瓶、250ml憐酸钟缓冲液及其 管路于12rC灭菌20min。灭菌后依次组装发酵罐的所有电路及管路系统。
[012引发酵
[0124] 打开上位机和空气压缩机，W火焰接种法从接种口依次加入250ml憐酸钟缓冲 液、2ml消泡剂（Antifoam204SIGMA)和2mlkan+(50mg/ml)。在上位机上设定如下培养 条件：溫度37°C，通气量2(K)L/h，抑7. 0,转速5(K)r/min，在此状态下标定DO电极的100% 值。适度调节气压，从取料口留取50ml培养基作为对照。停止揽拌和通气，向罐内无菌接 入150ml种子液，调节通气量为2(K)LA，转速5(K)r/min，然后点击发酵开始，保存本批次发 酵记录。通过取料口取10ml培养基作为化对照。发酵过程中通过调节通气量和转速使 DO保持在30%左右，将溫度设置为自动控制。通过自动滴加补酸液化4MH°C1)和补碱液 (4. 18M氨水）调节抑值。当发酵至化左右时，培养基中碳源耗尽溶氧值迅速上升，开始 向罐内连续滴加补料液400ml(每400ml含酵母提取物12. 5g，甘油240ml)。补料过程中通 过调节补料液的滴加速度、转速和通气量，尽量使DO保持在20%左右，此过程中转速一般 保持在70化/min左右。当发酵至1化从接种口无菌加入1. 25mlIPTG化2g/ml)至终浓度 为0. 4mM，调节溫度为3rC，共诱导化。发酵过程中每小时取样10ml，用于细菌生长动态监 。发酵结束时，降低通气量和转速，点击发酵结束，保存数据。将发酵液转入无菌Ξ角瓶 中，关闭气源。
[0125] 细菌生长动态监测
[0126] 用ΤΒ培养基调零，测定发酵过程中每小时所留菌液在600nm处的吸光度ODe。。;取 10ml菌液，4°C，9400Xg离屯、lOmin，弃上清，用棉签吸干残余液体，称量菌体湿重（WCW)。目 的蛋白表达效果用SDS-PAGE分析，取诱导前及发酵结束菌液各1. 5ml，离屯、弃上清。沉淀重 悬于O.SmlPBS中，超声波裂解，裂解条件为：功率400W，工作4S，停6S，共约25个循环。裂 解液14000Xg离屯、lOmin，取50μ1上清液电泳。
[0127] 发酵产物保存
[012引将发酵液置4°C静置过夜后轻轻弃上清，沉淀于4°C，4000Xg离屯、20min，弃上清， 收集菌泥，W每份约lOg置-20°C保存备用。
[0129] 重组螺旋藻SOD的纯化
[0130] 重组菌裂解
[013。 将4~8g重组菌沉淀充分重悬于80ml非变性结合缓冲液60mMNaHzPCVO. 5M化Cl，lOmM咪挫，pH7. 4)中。连接好纳米高压均质机气路系统，打开空气压缩机。用约100ml 蒸馈水清洗均质机。将待裂解细菌悬液加入进样桶内，15000psi压力均质细菌至裂解液透 亮。58°C水浴加热处理lOmin后，于9400Xg，-4°C离屯、30min，0. 45μm滤器过滤除去细胞 碎片，滤液可直接上柱。
[0132] 柱纯化
[0133] 取45ml空层析柱1支，用Ni-NTAAgarose树脂填满。将柱子用约150ml蒸馈水淋 洗后用约150ml非变性结合缓冲液平衡。将处理好的细菌裂解液通过蠕动累滴入柱中，上 样过程中若核酸蛋白检测仪读数上升较大，则收集流出液一管。用约200ml非变性淋洗缓 冲液巧OmM胞&?〇4,〇. 5M化Cl，20mM咪挫，抑7. 4)洗涂柱子至吸光值近本底且不再降低。 过程中需收集吸光值上升、峰值、下降期流出液至少各1管。用低pH洗脱液巧OmMNaHzPCV 0. 5M化C1，0.IMKCl，pH4. 5.)洗脱柱子，当吸光值上升至约0. 080时开始收集洗脱液，至吸 光值下降至0. 080W下后停止收集。纯化后用约200ml蒸馈水淋洗柱子。用SDS-PAGE检 测蛋白纯化效果。
[0134] 纯酶液浓度和活性测定
[0135] 采用化oa壯ord法测定纯酶液浓度。采用微量连苯Ξ酪自氧化法测定酶的活性。 酶活性定义为25°C时，1ml反应液中每Imin抑制连苯Ξ酪自氧化速率达50 %时的酶量为一 个活性单位。
[0136] 非变性凝胶电泳
[0137] 配制含12%分离胶和0. 5%浓缩胶的非变性凝胶。浓缩胶缓冲液为 1. 5MTris(p册.8)，分离胶缓冲液为0. 5MTris(p册.8)，胶中不加SDS。向电泳槽中加入 非变性电极缓冲液（0. 025MTris，0. 2M甘氨酸，P册.3)。将蛋白样品与样品缓冲液（0. 1M Tris-HCl，10%甘油，0.Olmg/ml漠酪蓝，P册.8)等体积混匀，直接上样。接通电源（上槽接 负极），130伏恒压电泳至样品进入分离胶，后调节电压180伏至电泳结束。取出凝胶，置超 纯水中放入微波炉中煮7min，共2次。用超纯水快速漂洗凝胶并去掉自由水，将胶放入超级 灵敏度蛋白质电泳快速染液中，置微波炉煮2min，然后置脱色摇床轻摇染色lOmin。最后将 胶浸泡在蒸馈水中清洗，拍照保存结果。
[0138] 重组SOD的NBT染色
[0139] 重组SOD的非变性凝胶电泳分离
[0140] 分别将50μ1纯化的SOD与等体积的50mMPBS、25mM&〇2溶液、50mMH202溶液、 氯仿-乙醇（体积比3 : 5)混合，置37°C溫箱解育比后，进行非变性凝胶电泳。电泳后将 蛋白Marker连同其邻近