一种包含高效杀伤启动机制的肿瘤精准t细胞及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫学和细胞生物学领域，设及包含高效杀伤启动机制的肿瘤精准Τ 细胞及其用途。具体地，设及一种Τ细胞治疗技术，特别地该技术W肿瘤特异性Τ细胞为对 象，通过转基因修饰方法转入可快速启动并增强Τ细胞杀伤功能的元件，例如识别肿瘤细 胞广谱表达、具有中等亲和力的嵌合抗原受体基因。本发明还设及获得的Τ细胞用于治疗 恶性肿瘤的用途。
【背景技术】
[0002] 近年来，肿瘤免疫治疗取得重大突破。利用嵌合抗原受体（chimericantigen receptors,CAR)修饰的Τ细胞（简称CAR-T)治疗复发难治性B细胞白血病，有效率达到 90%;利用PD-1抗体单药治疗多种类型恶性肿瘤，有效率达到10-30%。事实上，运两种方 法最终发挥作用的均是肿瘤特异性T细胞（Tumor-specific切totoxicTLympho巧tes， CTL)，其中前者是在患者自体初始Τ细胞基础上，通过体外转基因修饰的方法实现；而后者 是通过原位重新激活患者体内残留的肿瘤特异性Τ细胞的方法实现。因而，肿瘤免疫治疗 成功的关键是如何更好的发挥肿瘤特异性Τ细胞的功能。
[0003] Τ细胞活化需要两个信号的刺激。其中，Τ细胞表面TCR-CD3复合体与抗原提呈 细胞（例如树突状细胞，Demlriticcells,DC)表面抗原肤-MHC分子复合物结合，提供Τ 细胞活化的第一信号。活化后的T细胞能特异识别具有相同表面抗原肤-MHC分子复合物 的祀细胞，发挥杀伤作用。但肿瘤细胞第一信号刺激源（如MHC分子）缺乏或表达下降，无 法有效提供T细胞活化相关的信号，从而激活T细胞免疫反应。尽管有研究表明，活化的T 细胞能分泌IFN丫及TNFα，该两分子一方面能诱使肿瘤细胞MHC分子的表达上调，使其重 新恢复免疫原性，被Τ细胞有效识别与攻击；但另一方面，IFN丫及TNFa也可诱导肿瘤细 胞上调PDL1分子的表达，结合到T细胞表面PD1上，促使T细胞失活，从而逃逸T细胞的攻 击。所W，运一过程需要最初参与的肿瘤特异性T细胞具有足够数量，才能产生一开始就大 量IFN丫及TNFa，高效启动T细胞的杀伤作用，并通过正反馈作用灯细胞在首轮杀灭相应 肿瘤细胞时，释放IFN丫及TNFa使其它肿瘤细胞更易被T细胞识别；更多肿瘤细胞可被识 别后，T细胞接受的刺激放大，可W在杀伤过程中分泌更多的IFN丫及TNFα);而且，该杀伤 作用必需启动迅速，在肿瘤细胞通过上调PDL1表达形成免疫逃逸机制前，完成杀伤作用。
[0004] 遗憾的是，肿瘤组织具有高度的异质性，不同肿瘤患者、同一肿瘤患者不同病灶、 乃至同一病灶不同肿瘤细胞均可能具有不同的分子特征。针对单一祀点的肿瘤特异性Τ细 胞在遇到异质性肿瘤细胞群后，由于表达该祀点的肿瘤细胞局限在一定比例，Τ细胞难W接 受足够的刺激，启动前述的正反馈杀伤；而针对多个祀标的肿瘤特异性Τ细胞群，虽然整体 上能更有效的识别异质性肿瘤细胞群，但由于体外培养条件的限制，Τ细胞群中每种针对特 定祀点的Τ细胞的数量相对有限，客观上难W启动对血1C分子下调的肿瘤细胞的正反馈杀 伤作用。综上所述，肿瘤特异性Τ细胞的高效启动杀伤异质性、MHC分子下调的肿瘤细胞仍 是个难题。
[0005] τ细胞活化的第二信号，也称作共刺激信号，由τ细胞表面的共刺激分子（如 CD28、CD137、CD134等）与抗原提呈细胞相应配体（如B7、CD13化、CD13化等）结合来提供， 能增强T细胞的增殖与存活能力。然而，肿瘤细胞一般不具有提供T细胞第二信号的刺激 源，而在肿瘤部位具有正常功能的抗原提呈细胞的数量又有限，所WT细胞第二信号的刺 激源整体匿乏。更加不利的是，肿瘤细胞及其基质细胞还能通过分泌一些抑制免疫的因子 (如TGF0、VEGF、ID0)或通过直接接触（如上调肿瘤表面PDkl，结合到T细胞表面PD-1 上，诱导T细胞调亡），使T细胞失活。所W，也亟需为活化的T细胞提供第二信号的支撑， 使其更好的发挥作用，延长体内存活时间。
[0006] 嵌合抗原受体CAR由一个识别肿瘤细胞表面抗原的单链抗体（scFv，由抗体V厄 氨基酸序列和Vh区氨基酸序列经Linker连接而成），通过较链结构与跨膜、胞内信号结构 连接构成。表达CAR的T细胞可识别肿瘤细胞表面抗原，通过非MHC限制性途径与抗原反 应，使肿瘤细胞无法通过下调MHC分子形成免疫逃逸。此外，与常规的TCR只能针对的蛋白 抗原相比，CAR并不局限于蛋白抗原，还包括糖类和糖脂类TAA，而运些抗原不像蛋白抗原 那么容易突变（CurrOpinImmunol2009;21:215-23;Blood2010 ;116:1035-44;Cancer Res2011;71:3175-81;JCancer2011;2:378-82)。自 1989 年，由EsUiar和其同事首次 提出CAR的概念W来，其已经历了Ξ个不同的发展阶段。第一代CAR受体，包含胞外特异 识别肿瘤抗原的scFv片段，胞内激活信号由CD3ζ或化εRI丫的ITAMQmmunoreceptor tyrosine-basedactivationmotifs)信号链来传递。但是第一代CAR受体缺乏T细胞 的共刺激信号，导致T细胞只能发挥瞬间效应，在体内存在时间短、细胞因子分泌少。第二 代CAR受体在第一代CAR的基础上增加了一个共刺激信号分子的胞内结构域，提供T细胞 活化的两种信号，包括如CD28,CD134/0X40,CD137/4-1BB，lympho巧te-specificprotein tyrosinekinase(LCK)，inducibleT-cellco-stimulator(ICOS)从及DNAX-activation proteinlO(DAPlO)等结构域，增强了T细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，IL-2、 IFN- 丫W及GM-CSF增加，从而突破肿瘤微环境的免疫抑制、延长AICD(activation imlucedcelldeath，AICD)。第Ξ代CAR受体，在第二代CAR的基础上，增加了另外一种共 刺激信号分子的胞内结构域，如在共刺激结构CD28和ITAM信号链的之间再融合一个二级 共刺激分子如4-1BB，产生一个Ξ重信号的CAR受体，第Ξ代CAR受体改造的T细胞具有更 好的效应功能和体内存活时间。但随之给临床治疗带来了一定风险，因为第二代与第Ξ代 CAR修饰后T细胞会针对某些少量表达肿瘤相关抗原的正常组织产生超强的反应，呈"瀑 布"式过量增加，造成对正常组织的过激免疫反应。目前已有两个注射CAR修饰后的T细胞 而导致死亡的病例报道。其一例应用第Ξ代CAR(针对化r2)，患者由于急性肺水肿而死亡， 其原因是CAR"的T细胞误攻击低表达化r2的肺上皮细胞（Mol化er2010;18:843-51); 另一例应用第二代CAR(针对CD19)，死亡原因复杂，但伴随着血液中细胞因子水平的增 高（HumGeneTher2010;21:1039-42;MolTher2010;18:666-8)。为解决运一安全性 隐患，研究者将服ν-ΤΚ、ΔFas、i化sp9、CD20-化化ximab等自杀系统引入Τ细胞的CAR修 饰，发挥刹车作用，避免T细胞过量增殖（JCancer2011 ;2:378-82;N&iglJMed2011 ; 365:1673-83)。然而，CAr的Τ细胞脱祀引发的"瀑布"效应速度非常快，运些自杀系统未 必能及时发挥作用。另一种方法是减少CAr的Τ细胞回输数量，运种方案随之使治疗疗效 下降。所W，亦亟需引进新的分子刹车系统，提高CAR-T细胞治疗的安全性。
【发明内容】
[0007] 本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，制备了对肿瘤细胞表面广谱表达膜抗 原具有中等亲和力结合特性的嵌合抗原受体基因。在肿瘤特异性T细胞（具有识别肿瘤抗 原的TCR基因）的基础上，通过转基因修饰方法导入对肿瘤细胞表面广谱表达膜抗原具有 中等亲和力结合特性的嵌合抗原受体基因。由此制备了新一代的肿瘤精准T细胞，又称白 泽T。白泽T可在中等亲和力结合特性的嵌合抗原受体作用下快速启动T细胞激活，该嵌 合抗原受体激活信号将与肿瘤特异性T细胞中天然识别肿瘤抗原的TCR信号叠加，激活肿 瘤特异性T细胞在肿瘤微环境中增殖、生长，并通过肿瘤抗原特异性TCR精准杀灭肿瘤细 胞；同时中等亲和力结合的嵌合抗原受体也可直接对高表达肿瘤膜蛋白的肿瘤细胞进行杀 伤，其释放出干扰素丫及肿瘤坏死因子α，使异质性肿瘤细胞的血1C上调并提呈出肿瘤抗 原，使白泽Τ更容易识别运些异质性肿瘤细胞，从而对其精准杀灭。白泽Τ通过肿瘤特异 性TCR与嵌合抗原受体第一及第二信号作用下形成记忆Τ细胞的表型，可在体内发挥长效 作用，同时也避免传统CAR-T细胞中的TCR引起的非肿瘤杀伤能力。其刹车开关也将进一 步提高其安全性。
[000引由此提供了下述发明：
[0009] 本发明的一个方面设及一种Τ细胞，其包含
[0010] (1)具有识别肿瘤抗原的TCR基因，W及 W11] 似嵌合抗原受体基因；
[0012] 其中，所述嵌合抗原受体，依次包含信号肤、结合肿瘤细胞膜抗原的多肤、较链区、 跨膜区和胞内信号区，
[0013] 所述结合肿瘤细胞膜抗原的多肤能够W中等亲和力结合肿瘤细胞广泛表达膜抗 原，所述嵌合抗原受体插入有抗原表位，插入的位置选自如下3个位置中的任意1个、2个或 3个：
[0014] 信号肤与结合肿瘤细胞膜抗原的多肤之间，结合肿瘤细胞膜抗原的多肤内部，W 及结合肿瘤细胞膜抗原的多肤和较链区之间；
[0015] 所插入的抗原表位为单拷贝或者多拷贝（例如2、3、4或5个拷贝）；当所述位置 大于1个时，不同位置的抗原表位相同或者不同；
[0016] 优选地，所述抗原表位不是所述肿瘤细胞膜抗原的表位。
[0017] 上述"结合"包括但不限于：抗原与抗体的特异性结合，W及配体与受体的结合。
[0018] 优选地，其中所述的能够结合肿瘤细胞广泛表达的膜抗原的多肤能够同时和两种 或多种上述膜抗原结合，使得本发明的嵌合抗原受体能够接受异质性肿瘤细胞群体的信号 刺激，W延长免疫反应细胞的效应时间。
[0019] 根据本发明任一项所述Τ细胞，其中，肿瘤细胞广泛表达膜抗原选自如下的任意 一种或者多种：
[0020] EGFR、EGFRvIII、ERBB2、ERBB3、ERBB4、MSLN、MUC1、VEGFR1、VEGFR2、EpCAM、CD44 和IGFRl。
[0021] 根据本发明任一项所述T细胞，所述结合肿瘤细胞膜抗原的多肤为天然多肤或人 工合成多肤，
[0022] 优选地，人工合成多肤为单链抗体或F油片段
[0023] 优选地，天然多肤为人类化r2基因第8个内含子化rin编码的氨基酸序列肥RIN; 优选地，为沈Q ID NO:5。
[0024] 根据本发明任一项所述Τ细胞，其中，所述抗原表位为可被美罗华抗体识别的 CD20抗原表位；优选地，其氨基酸序列如为SEQIDNO:4所示。
[00巧]根据本发明任一项所述T细胞，其中所述嵌合抗原受体还包括如下的（1)-(5)项 中