册-8910,胃癌细胞株BGC-828、HGC-27与MKN45,结直肠癌癌细胞株 SW480,膜腺癌细胞株PANC-1，肺癌细胞株H446与A549,胆囊癌细胞株GBC-SD、胆管癌细胞 株EH-GB1、胶质瘤细胞株Luxkl，骨肉瘤细胞株U-20S、正常肾胚细胞株肥K293巧H-GB1的 构建参照转移灶的人胆囊癌细胞系EH-GB1的建立及鉴定，中华肿瘤杂志.2010 ;2:84-7,其 余细胞株购自美国标准生物品收藏中屯、，ATCC)，置于xCE化igenceRTCADP多功能实时无 标记细胞分析仪上，实时记录细胞的生长情况测得的细胞指数，Cellindex来反映，数 值越高表明细胞状态越佳）。24小时后，分别按16:1、8:1、4:1、2:1的效祀比，加入化-T细 胞，重新置于xCE化igenceRTCADP多功能实时无标记细胞分析仪上进行细胞生长情况检 测。
[0110] 结果如图4A-图4M所示。Bz-T细胞对各种恶性肿瘤细胞株均具有良好的杀伤作用 (见图4A-化)，杀伤效率存在明显的量效关系（效祀比越高，杀伤作用越强）；杀伤作用非 常快速（在加入化-T细胞后，肿瘤细胞被快速杀伤）。反之，Bz-T细胞对正常细胞肥K293 细胞基本不杀伤（见图4M)。 阳111] W上结果表明，Bz-T对异质性肿瘤细胞具有高效、快速的杀伤能力，而对正常细胞 的毒性较小。 。…]连施例6 :化-T细胸的体内杀伤活忡鉴定 阳113] 在N0D-SCID小鼠（购自上海斯莱克实验动物有限公司）中皮下注射5X106的EH-GB1恶性胆管癌细胞，10天后经尾静脉分别注射化-T细胞、TIL细胞（实施例2制备） (注射剂量2X1〇5)或PBS缓冲液，测定移植瘤的生长状况。
[0114] 结果表明，相对于对照组，化-T细胞对胆管癌的抑制作用具有显著差异（图5)。 可见，Bz-T细胞在体内具有良好的抗肿瘤作用。
[0115] 连施例7 :化-T细胸的体内清除试輪（分子刹车功能的輪证）
[0116] 在BABL/c裸鼠（购自上海斯莱克实验动物有限公司）尾静脉注射化-T细胞（注 射剂量5X106)，3天后静脉注射100μg的美罗华抗体或人IgG对照抗体。12个小时后，采 集血液及骨髓样品，用流式细胞仪检测化-T细胞的比例（CD20与CD3双阳性细胞）。
[0117] 结果表明，相对于注射人IgG抗体的对照组，在注射美罗华抗体后，输注的化-T细 胞在血液与骨髓中的比例显著降低（图6)。可见，CD20分子刹车在体内能有效发挥作用， 可W通过ADCC及CDC效应将含有CD20表位的化-T细胞清除。
[0118] 尽管本发明的【具体实施方式】已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根 据已经公开的所有教导，可W对那些细节进行各种修改和替换，运些改变均在本发明的保 护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
【主权项】
1. 一种T细胞，其包含 ⑴具有识别肿瘤抗原的TCR基因，以及 (2)嵌合抗原受体基因； 其中，所述嵌合抗原受体，依次包含信号肽、结合肿瘤细胞膜抗原的多肽、铰链区、跨膜 区和胞内信号区， 所述结合肿瘤细胞膜抗原的多肽能够以中等亲和力结合肿瘤细胞广泛表达膜抗原，插 入有抗原表位，插入的位置选自如下3个位置中的任意1个、2个或3个： 信号肽与结合肿瘤细胞膜抗原的多肽之间，结合肿瘤细胞膜抗原的多肽内部，以及结 合肿瘤细胞膜抗原的多肽和铰链区之间； 所插入的抗原表位为单拷贝或者多拷贝（例如2、3、4或5个拷贝）；当所述位置大于1 个时，不同位置的抗原表位相同或者不同。2. 根据权利要求1所述的Τ细胞，其中，肿瘤细胞广泛表达膜抗原选自如下的任意一种 或者多种： EGFR、EGFRvIII、ERBB2、ERBB3、ERBB4、MSLN、MUC1、VEGFR1、VEGFR2、EpCAM、CD44 和IGFR1。3. 根据权利要求1所述的T细胞，其中所述结合肿瘤细胞膜抗原的多肽为天然多肽或 人工合成多肽， 优选地，人工合成多肽为单链抗体或Fab片段 优选地，天然多肽为人类Her2基因第8个内含子Herin编码的氨基酸序列HERIN;优 选地，为SEQIDN0:5。4. 根据权利要求1所述的T细胞，其中，所述抗原表位为可被美罗华抗体识别的CD20 抗原表位；优选地，其氨基酸序列如为SEQIDNO:4所示。5. 根据权利要求1所述的T细胞，所述嵌合抗原受体包含如下的（1)-(5)项中的任意 一项或者多项： (1) 所述信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示； (2) 所述铰链区选自CD8的胞外铰链区、CD28的胞外铰链区和CD4的胞外铰链区的任 意一种或多种；优选地为CD8的胞外铰链区；优选地，所述CD8的胞外铰链区如SEQIDNO:7 所示； (3) 所述跨膜区选自CD8的跨膜区、CD28的跨膜区和CD4的跨膜区的任意一种或多种； 优选地，为⑶8跨膜区；优选地，所述⑶8跨膜区的氨基酸序列如SEQIDN0:8所示； (4) 所述胞内信号区选自CD28、CD134/0X40、CD137/4-lBB、LCK、IC0S、DAP10、CD3G和 FcεRIγ任意一种或多种的胞内信号区，优选为4-1BB胞内信号区和CD3ζ胞内信号区，或 者CD28胞内信号区和CD3G胞内信号区；优选地，所述4-1ΒΒ胞内信号区和CD3G胞内信 号区的氨基酸序列分别如SEQIDΝ0:9和SEQIDΝ0:10所示；优选地，所述⑶28胞内信号 区和⑶3ζ胞内信号区的氨基酸序列分别如SEQIDNO: 11和SEQIDNO: 10所示； (5) 所述抗原表位与结合肿瘤细胞膜抗原的多肽直接相连或者通过蛋白linker相连； 优选地，所述蛋白linker为至少2个甘氨酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个甘氨酸。6. 根据权利要求1所述的T细胞，所述的嵌合抗原受体由信号肽、CD20抗原表位、人类 Her2基因第8个内含子Herin编码的氨基酸序列HERIN、⑶20抗原表位、⑶8铰链区、⑶8 跨膜区、4-1BB共刺激肽段依次此构成；优选地，其氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示。7. 根据权利要求1所述的T细胞，其中，所述肿瘤抗原为肿瘤相关抗原和/或肿瘤特异 性抗原； 优选地，所述肿瘤相关抗原选自如下的任意一种或者多种： NY-ES0-1 (又称CTAGlB，cancer/testisantigenlB)、gplOO(PMELpremelanosome protein)、MART-1(又称melan_A)、GD2(又称B4GALNT1，beta-l，4-N_acetyl-g alactosaminyltransferase1)、MUC1(mucin1,cellsurfaceassociated)、 MAGE(Melanoma-associatedantigenEl)家方矣蛋白、BAGE(Bmelanomaantigenfamily) 家族蛋白、GAGE(growthhormonereleasingfactor)家族蛋白、P53、hTERT、Wnt、0ct4、 EGF、muP53、HRas、KRas、P16、HGM、survivin、C-myc、SSX2、PSMA(Prostate-specific membraneantigen)、CEA、CA9(carbonicanhydraseIX)、FR(Flavinreductase)、CD171/ Ll-CAM、IL-13Ra2、AFP(alpha-fetoprotein)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、 CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-llRa、EGP-2、EGP-40、FBP、（?(又称ST8SIA1， ST8alpha-N-acetyl-neuraminidealpha-2, 8-sialyltransferase1)、PSCA(prostate stemcellantigen)、FSA(又称KIAA1109)、PSA(又称KLK3，kallikrein-related peptidase3)、HMGA2、fetalacetylcholinereceptor、LeY(又称FUT3)、EpCAM、 MSLN(mesothelin)、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB2、ERBB3、ERBB4、CA125 (又称MUC16,mucin 16,cellsurfaceassociated)、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC(X 称SERPINB3)、GPC3 (glypican-3)、AFU(又称FUCA1)、EBV-VCA、POA(又称VDR，vitamin D(l，25-dihydroxyvitaminD3)receptor)、β2-MG(beta-2-microglobulin)和PROGRP(GRP gastrin-releasingpeptide)； 优选地，所述肿瘤特异性抗原选自肿瘤细胞由基因变异导致的氨基酸改变所形成的新 抗原。8. 根据权利要求1所述的T细胞，所述T细胞为表达嵌合抗原受体基因的肿瘤浸润淋 巴细胞；优选地，所述肿瘤浸润淋巴细胞选自如下的任意一种或者多种肿瘤的肿瘤浸润淋 巴细胞： 肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊 癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌和前列腺癌。9. 一种药物组合物，其包含权利要求1至8中任一权利要求所述的T细胞，以及任选的 药学上可接受的辅料。10. -种试剂盒，其包含权利要求9所述的药物组合物，以及至少一种抗体，所述抗体 能够特异性地识别所述抗原表位；优选地，所述抗体为美罗华抗体。11. 权利要求1至8中任一权利要求所述的T细胞在制备治疗和/或预防和/辅助治 疗恶性肿瘤的药物中的用途；优选地，所述恶性肿瘤选自如下的任意一种或者多种： 肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊 癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌和前列腺癌。
【专利摘要】本发明属于免疫学和细胞生物学领域，涉及包含高效杀伤启动机制的肿瘤精准T细胞及其用途。具体地，本发明涉及一种对肿瘤细胞表面广谱表达膜抗原具有中等亲和力结合特性的嵌合抗原受体以及新一代的肿瘤精准T细胞，又称白泽T。中等亲和力结合特性的嵌合抗原受体作用下快速启动T细胞激活，该嵌合抗原受体激活信号将与肿瘤特异性T细胞中天然识别肿瘤抗原的TCR信号叠加，激活肿瘤特异性T细胞在肿瘤微环境中增殖、生长，并通过肿瘤抗原特异性TCR精准杀灭肿瘤细胞。本发明的肿瘤精准T细胞具有良好的抗肿瘤应用前景。
【IPC分类】C12N5/10, A61P35/00, A61K35/17, A61K39/395
【公开号】CN105331586
【申请号】CN201510812654
【发明人】钱其军, 金华君, 李林芳, 叶真龙, 章浩, 王颖, 吴红平, 吴孟超
【申请人】上海细胞治疗研究院, 上海细胞治疗工程技术研究中心有限公司, 中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月20日