用于肿瘤免疫治疗的多系活化杀伤细胞的制备方法
【专利摘要】本发明公开一种用于肿瘤免疫治疗的多系活化杀伤（Polylineageactivatedkiller，PAK）细胞的制备方法，通过从恶性肿瘤患者或健康人外周血分离单个核细胞，然后将外周血单个核细胞加入抗TCRγδ单抗和IFN-γ体外诱导PAK细胞，体外诱导72小时后，再将PAK细胞在抗TCRγδ单抗、抗CD3单抗和IL-2存在下进行扩增。制备出的PAK细胞应包含TCRγδ+细胞、CD3—CD56+（NK）细胞、CD3+CD56+（NKT）细胞以及CD3+CD8+细胞，具有更强的抗肿瘤效应，对人肺腺癌A549及人肺鳞癌YTMLC的杀伤活性均高于细胞因子诱导的杀伤（Cytokineinducedkiller，CIK）细胞。
【专利说明】用于肿瘤免疫治疗的多系活化杀伤细胞的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种人类肿瘤疾病的治疗方法，特别是一种专用于肿瘤免疫治疗的多 系活化杀伤（Polylineage activated killer, PAK)细胞的制备方法。
【背景技术】
[0002] 体内回输免疫活性细胞的过继细胞治疗（Adoptive cell therapy，ACT)与传统的 肿瘤治疗方法相比，可以在不损伤机体免疫系统结构和功能的前提下，直接杀伤肿瘤细胞； 同时调节和增强机体的免疫功能，因而成为肿瘤手术、放疗和化疗的重要辅助治疗方法，为 预防肿瘤复发、转移，改善晚期肿瘤患者的生存质量提供了新的途径。ACT已在恶性黑色素 瘤、肾癌、淋巴瘤等肿瘤治疗中取得了一定疗效。
[0003] 人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中含有多种 具有杀伤肿瘤细胞活性的免疫效应细胞，如TCRgd+ T细胞、⑶3一⑶56+ NK细胞、⑶3+⑶56+ NKT细胞及⑶3+CD8+ T细胞等。这些效应细胞具有不同的识别、杀伤肿瘤细胞的特性。
[0004] 1、自然杀伤（Nature killer，NK)细胞无需抗原预先致敏即可直接杀伤靶细胞，且 不具有"主要组织相容性复合物（Major histocompatibility complex,MHC)限制性"，而肿 瘤细胞往往缺乏MHC I类分子的有效表达，因此，NK细胞在抗肿瘤免疫中具有重要的作用。
[0005] 2、自然杀伤样T(Natural killer T，NKT)细胞是免疫细胞中一个具有特定标志的 T细胞亚群。NKT细胞表面既表达T细胞表面标志，如⑶3、TCR，又表达NK细胞的表面标志， 如CD56、CD122等。NKT细胞只能识别由CDld分子递呈的特异性糖脂类分子，而不能识别由 MHC分子递呈的抗原肽，比如α -半乳糖神经酰胺（a -galactosylceramide, a -GalCer) 能以CDld限制的和TCR介导的方式激活NKT细胞。经活化的NKT细胞既可直接作为抗肿 瘤效应细胞发挥杀伤作用，又能通过激活其他免疫效应细胞，如NK细胞，间接实现抗肿瘤 作用。
[0006] 3、在人类的外周血中，大多数的T细胞表达α β型的T细胞受体（T cell rec印tor，TCR)。表达有γ δ型TCR的T细胞仅占外周血中CD3+ T细胞的59Γ10%，并且 在脾和淋巴结中的分布很少，而是大量地分布于粘膜相关淋巴组织（Mucosal associated lymphocytes tissue, MALT),如肠、皮肤、食管、气管、肺和生殖道上皮，是上皮内淋巴细胞 (Intraepithelial lymphocyte, IEL)的主要成分之一。研究表明甲轻戊酸代谢产物如异戊 烯焦磷酸（IPP)可直接作用于gdTCR，进而促使gdT细胞活化、增殖。活化的gdT细胞识别 上皮来源肿瘤细胞表达的非经典MHC-Ι类分子MICA/MICB，这是一种不需要抗原提呈的MHC 分子非依赖的途径。因此，gdT细胞可能对识别和杀伤那些逃避了 α βΤ细胞的肿瘤细胞 提供了一个选择和弥补的方式。
[0007] 4、体外扩增培养的⑶8+ Τ细胞表面NKG2D的表达明显上调，通过抗体封锁、间接 的细胞溶解分析以及siRNA研究证实纯化的CD8+ Τ细胞抗肿瘤细胞的细胞毒作用是通过 NKG2D介导的识别和信号传导，而不是通过TCR。小鼠⑶8+CD44high T细胞表达低水平的 NKG2D受体，经IL-2激活后表达高水平的NK细胞受体NKG2D及2B4,并对表达NKG2D配体 Rae-1的同基因肿瘤细胞具有极大的杀伤效应。
[0008] 目前ACT多采用一种或几种效应细胞刺激剂制备免疫效应细胞，获得的免疫效应 细胞的杀伤活性通常来自某一个具有特定表型的细胞群，如CIK中的CD3+CD56+ NKT细胞。 肿瘤的一个非常重要的特性是其"异质性"，因此，仅采用一种具有特定表型的效应细胞难 以彻底清除肿瘤细胞，其疗效及适用性较差。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种用于肿瘤免疫治疗的多系活化杀伤细胞的制备方法，应 用抗TCRY δ单抗、IFN-γ从人外周血单个核细胞中活化TCRY δ+、⑶3一⑶56+、⑶3+⑶56+、 ⑶3+CD8+细胞并在IL-2、抗TCR γ δ单抗和抗⑶3单抗存在下进行大量扩增，最终获得对肿 瘤细胞具有更强杀伤活性的多系活化杀伤（Polylineage activated killer, ΡΑΚ)细胞。
[0010] 一种用于肿瘤免疫治疗的多系活化杀伤细胞的制备方法，具体为： 步骤一，从恶性肿瘤患者外周血分离单个核细胞，即是采集外周血并分离PBMC的步 骤。采集恶性肿瘤患者或者健康人外周血时可加入肝素、枸橼酸或乙二胺四乙酸（EDTA)抗 凝以防止采血过程中发生凝血。分离PBMC采用密度梯度离心法。
[0011] 步骤二，将外周血单个核细胞加入抗TCRY δ单抗和IFN-Y体外诱导PAK细胞， 体外诱导时间为72小时；TCR/CD3复合体中的两个多态型亚单位TCRa β和TCRy δ主要 功能是识别、结合MHC分子-抗原肽复合物，但胞浆区非常短。抗原或TCR复合体相应抗体 的刺激可以激活Τ细胞多种信号传导途径，它们各自发挥级联（cascade)反应，调节最初的 活化步聚，并将信号转导进入细胞核内，触发在遗传上预先确定的若干个途径中的某一个 或几个途径，并诱导T细胞的增殖和分化，从而发挥其效应功能。研究表明甲羟戊酸代谢产 物如异戊烯焦磷酸（IPP)或抗TCRY δ单克隆抗体可直接作用于gdTCR，进而促使gdT细 胞活化、增殖。因此，采用抗TCRY δ单克隆抗体可以有效地诱导、扩增TCRY δ+ T细胞。 IFNi可以活化⑶3+⑶8+ Τ细胞以及⑶3+CD56+ ΝΚΤ细胞。因此，采用IFNi和抗TCRy δ 单克隆抗体联合培养PBMC可以同时活化、诱导其中具有抗肿瘤活性的细胞亚群。诱导ΡΑΚ 细胞的时间优选3天，因为这可以使TCR γ δ +、⑶3+CD56+ NKT等细胞得到充分活化和优势 扩增。
[0012] 步骤三，将PAK细胞在抗TCRY δ单抗、抗⑶3单抗和IL-2存在下进行扩增，制 备出的ΡΑΚ细胞应包含TCRy δ +细胞、CD3一CD56+ (ΝΚ)细胞、CD3+CD56+ (ΝΚΤ)细胞以及 CD3+CD8+细胞。
[0013] ΡΑΚ体外诱导、扩增选用适合人淋巴细胞培养的无血清培养基，如GT-T551、 AM-V、X-Vivo、CellGro。
[0014] 现在常用于体外制备治疗肿瘤用的免疫细胞细胞培养的完全培养基中的血清包 括人AB血清，商业化的正常人AB血清虽经HBV、HCV及HIV等检测，但仍有可能传播其他疾 病，安全性低；并且存在批间差异、不易质控，质量不能保证。自体血清或血浆的使用可以避 免上述问题，本发明方法优选使用自体血浆，培养基含有自体血浆采用步骤一中分离外周 血获得的自体血浆。血浆中含有的大量血浆蛋白可以为PAK细胞的生长提供必要的营养。 不灭活补体的血液制品具有溶血作用，通常采用56° C、30分钟灭活补体。补体失去活性， 对细胞就没有破坏作用了。因此，本发明方法优选将自体血浆经56° C水浴孵育30分钟以 灭活血浆中补体。
[0015] 本发明所制备的PAK细胞中包含TCR γ δ +细胞、⑶3一⑶56+ NK细胞、⑶3+⑶56+ ΝΚΤ细胞和⑶3+CD8+ Τ细胞。⑶3+CD56+ ΝΚΤ细胞是CIK细胞的主要成分。因此，比起CIK 细胞，ΡΑΚ细胞将具有更强的抗肿瘤效应。本发明制备的ΡΑΚ细胞对人肺腺癌Α549及人肺 鳞癌YTMLC的杀伤活性均高于CIK细胞。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1本发明体外培养ΡΑΚ细胞第14天TCRY δ +细胞表型检测结果。
[0017] 图2本发明体外培养ΡΑΚ细胞第14天⑶3_OT56+和⑶3+⑶56+细胞表型检测结 果。
[0018] 图3本发明体外培养PAK细胞第14天⑶3+⑶8+细胞表型检测结果。
[0019] 图4本发明体外培养PAK细胞和CIK细胞对人肺腺癌A549细胞的杀伤活性检测 结果。
[0020] 图5本发明体外培养PAK细胞和CIK细胞对人肺鳞癌YTMLC细胞的杀伤活性检测 结果。
[0021] 图6本发明体外诱导1天和3天获得的PAK细胞对人肺腺癌A549细胞的杀伤活 性检测结果。
[0022] 图7本发明体外诱导1天和3天获得的PAK细胞对人肺鳞癌YTMLC细胞的杀伤活 性检测结果。
【具体实施方式】
[0023] -种用于肿瘤免疫治疗的多系活化杀伤细胞的制备方法，具体为： 步骤一，从恶性肿瘤患者或者健康人外周血分离单个核细胞： 外周血单个核细胞分离：无菌状态下采集人外周血50mL。血液采集使用50mL注射器， 抗凝剂采用肝素，使用浓度为每毫升外周血加入15IU肝素，肝素溶液与血液体积比为1:9。 将抗凝血注入50mL离心管中，400g离心10分钟；小心吸取上层血浆至50mL离心管中，剩余 抗凝血按1:1加入生理盐水并充分混匀；取50mL离心管，加入人外周血淋巴细胞分离液(天 津灏洋)，在淋巴细胞分离液上层小心加入稀释外周血，分离液与外周血体积比为1:2 ;400g 离心20分钟；小心吸取白膜层细胞至50mL离心管中，加入2倍体积的生理盐水，400g离心 10分钟；小心吸掉上清液，用新鲜配制人淋巴细胞培养基（GT-T551，大连宝生物工程）重新 混悬细胞；台盼蓝染色法计数细胞浓度并将细胞浓度调整为1X 1〇6细胞/mL。
[0024] 含自体血浆人淋巴细胞培养基配制：将上述分离获得的血浆放入56° C水浴中 孵育30分钟；取500mL人淋巴细胞培养基（GT-T551)，加入已灭活补体的血浆，终浓度为 1 ?5%。
[0025] 步骤二，将外周血单个核细胞加入抗TCR γ δ单抗和IFN- γ体外诱导PAK细胞， 体外诱导时间为72小时： 1、抗体包被培养瓶的准备，吸取抗TCRY δ (克隆号Β1，美国BD Biosciences)和/或 抗0)3单抗（Orthoclone 0KT3,美国Johnson&Johnson(J&J)公司）到生理盐水中配制浓度 为2μ g/ml抗体溶液，将5ml抗体溶液加入到75cm2培养瓶(美国Corning)中，轻轻摇晃培 养瓶使溶液在培养瓶底面均匀分布。将培养瓶放至4° C冰箱中。24小时后从冰箱中取出 培养瓶，小心吸掉培养瓶中抗体溶液。使用前以人淋巴细胞培养基洗涤3次。
[0026] 2、PAK细胞的体外诱导，将新鲜分离的外周血单个核细胞加入到抗TCRY δ单抗 包被的75cm2培养瓶中，按1000IU/mL加入重组人IFN- γ (上海凯茂生物医药）；将培养瓶 放入37° C、5%C02、饱和湿度培养箱中培养3天。
[0027] 步骤三，将PAK细胞在抗TCRY δ单抗、抗⑶3单抗和IL-2存在下进行扩增， 将诱导至第3天的ΡΑΚ细胞转移至抗TCRY δ和抗⑶3单抗包被的75cm2培养瓶中， 按1000IU/mL加入重组人IL-2 (北京四环生物制药）；将培养瓶放入37° C、5%C02、饱 和湿度培养箱中培养，每2-3天添加新鲜培养基和重组人IL-2并将PAK细胞转移至 640cm 2培养袋（GT-T610(A)，大连宝生物工程）中继续培养。待培养至第14天时，可获得 0. 5X109?1X101qPAK细胞。制备出的PAK细胞应包含TCRy δ +细胞、CD3一CD56+ (NK)细 胞、⑶3+⑶56+ (ΝΚΤ)细胞以及⑶3+⑶8+细胞。
[0028] ⑶3分子是Τ细胞的重要标志，由Υ、δ、ε、ζ和η五种多肽链组成，它们的胞 浆区均含有ΙΤΑΜ，具有传导TCR信号的功能，使Τ细胞活化。CD3分子与TCR以非共价键结 合形成TCR-CD3复合物，其主要功能是把TCR与抗原结合后产生的活化信号传递到细胞内， 诱导Τ细胞活化。因此，抗CD3单抗是目前各种抗肿瘤免疫细胞制备最重要的一种刺激因 子。本发明方法同样采用抗CD3单抗对ΡΑΚ细胞进行大量扩增以获得可供临床治疗使用的 细胞数量。
[0029] 经多次测试，以ΡΑΚ细胞中γ STCR表达的流式直方图表示，X轴是PE-TCRY δ抗 体标记的细胞，Υ轴是细胞计数。该直方图中虚线区域表示同型对照抗体标记的ΡΑΚ细胞， 以虚线区域为基线划定C门，黑色区域表示ΡΕ-TCRy δ抗体标记的ΡΑΚ细胞，C门内细胞 为TCRY δ +的细胞。根据本发明实施方式制备的ΡΑΚ细胞中TCRY δ +细胞比例高于80%。
[0030] 以显示ΡΑΚ细胞中⑶3和⑶56表达的流式散点图表示，其中X轴是FITC-⑶3抗 体标记的细胞，Υ轴是PE-CD56抗体标记的细胞。该散点图将ΡΑΚ细胞划分为四个区域，其 中左上部分（Κ1)显示⑶3+⑶56+ΝΚ细胞，右上部分（Κ2)显示⑶3+CD56+NKT细胞。根据本发 明实施方式制备的ΡΑΚ细胞中CD3+CD56+NK细胞比例高于10% ;CD3+CD56+NKT细胞比例高于 60%。
[0031] 另以显示PAK细胞中⑶3和⑶8表达的流式散点图表示，X轴是E⑶-⑶3抗体标 记的细胞，Y轴是PE-Cy5-⑶8抗体标记的细胞。该散点图将PAK细胞划分为四个区域，其 中右上部分（S2)显示⑶3+CD8+ T细胞，根据本发明实施方式制备的PAK细胞中⑶3+⑶8+ T 细胞比例高于60%。
[0032] 根据本发明，通过在IFN-γ、抗TCRY δ单抗、抗⑶3单抗和IL-2存在下诱导、扩 增人外周血单个核细胞，可以获得ΡΑΚ细胞。该ΡΑΚ细胞中包含TCRy δ +细胞、⑶3+⑶56+ ΝΚ细胞、⑶3+⑶56+ ΝΚΤ细胞和⑶3+CD8+ Τ细胞。⑶3+⑶56+ ΝΚΤ细胞是CIK细胞的主要成 分。因此，比起CIK细胞，ΡΑΚ细胞将具有更强的抗肿瘤效应。经检测显示体外培养ΡΑΚ细 胞杀伤肿瘤细胞的检测结果。在效靶比20:1、10:1、5:1时，本发明制备的ΡΑΚ细胞对人肺 腺癌Α549及人肺鳞癌YTMLC的杀伤活性均高于CIK细胞。
[0033] 体外培养第14天时，诱导1天和3天分别获得的ΡΑΚ细胞杀伤肿瘤细胞的检测结 果表明，在效靶比20:1、10:1、5:1时，体外诱导3天制备的ΡΑΚ细胞对人肺腺癌Α549及人 肺鳞癌YTMLC的的杀伤活性高于诱导1天制备的PAK细胞。
[0034] 培养至第14天时，收集PAK细胞。另外收集人肺癌细胞A549和YTMLC。乳酸脱 氢酶（Lactate dehydrogenase, LDH)释放法(美国Promega)检测PAK细胞杀伤肿瘤细胞活 性。
[0035] 收集传代培养且生长状态良好的靶细胞：人肺腺癌细胞系A549和人肺鳞癌细胞 系YTMLC用RPMI-1640培养基洗两次，重悬于含5%FBS的RPMI-1640培养基中。调整细胞 浓度为2 X 105细胞/mL，将细胞按照50 μ L/孔加入到U形底96孔板中，300g离心3分钟， 放37°C、5%C02、饱和湿度培养箱中培养。
[0036] 收集本发明制备的中生长状态良好的PAK细胞，洗涤后重悬于含5%FBS的 RPMI-1640培养基按效靶比20:1、10:1、5:1分别调整细胞浓度为4 X 106细胞/mL、2 X 106细 胞/mL、1 X 106细胞/mL，将细胞按照50 μ L/孔加入到靶细胞孔中。
[0037] 设效应细胞自发释放孔，每孔加入4 X 106细胞/mL、2 X 106细胞/mL、1 X 106细胞/ mL效应细胞和培养液各50 μ L。
[0038] 设靶细胞自发释放孔，每孔加入2 X 105细胞/mL靶细胞和培养液各50 μ L。
[0039] 设靶细胞最大释放孔，每孔加入2 X 105细胞/mL靶细胞和培养液各50 μ L。
[0040] 上述各项均设三个复孔，于37°C、5%C02培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以 300g离心4min，每孔吸取上清50 μ L至平底96孔培养板(酶标板)中，同时加入LDH基质液 50 μ L，室温、避光孵育30min，每孔加入终止液50 μ L，加样器去除气泡；酶标仪490nm处测 定光密度值（Optical density, 0D)。
[0041] 杀伤活性计算
【权利要求】
1. 一种用于肿瘤免疫治疗的多系活化杀伤（Polylineage activated killer, PAK)细 胞的制备方法，其特征在于：制备方法具体为： 步骤一，从恶性肿瘤患者或健康人外周血分离单个核细胞； 步骤二，将外周血单个核细胞加入抗TCR γ δ单抗和IFN- γ体外诱导PAK细胞，体外 诱导时间为72小时； 步骤三，将ΡΑΚ细胞在抗TCRY δ单抗、抗CD3单抗和IL-2存在下进行扩增，制备出的 ΡΑΚ 细胞应包含 TCR γ δ + 细胞、CD3一CD56+ (ΝΚ)细胞、CD3+CD56+ (ΝΚΤ)细胞以及 CD3+CD8+ 细胞。
【文档编号】C12N5/0786GK104232578SQ201410436844
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】苏晓三, 汪珺, 王翼寅, 陈睿, 杨柳, 张蕾 申请人:昆明市第一人民医院