本发明涉及肿瘤免疫治疗(Cancer Immunotherapy)中的免疫检查点抑制剂，具体涉及2-取代异烟酸类化合物、其制备方法及其作为肿瘤免疫治疗中的免疫检查点抑制剂的用途。
背景知识
恶性肿瘤作为全球较大的公共卫生问题之一，极大地危害人类的健康并影响人类的生产生活。从世界范围来看，2012年全球新发癌症病例约有1410万，死亡820万，现患癌症病例3260万。(Ca A Cancer Journal for Clinicians 2011，61：69)同时恶性肿瘤已不再只是发达国家的严重疾病，发展中国家也面临着更大的疾病负担。人类在与恶性肿瘤的抗争中，主要有手术、化疗、放疗、内分泌治疗、靶向治疗等治疗手段，而肿瘤免疫治疗不同于这些治疗手段，旨在激活自身免疫系统来杀死肿瘤细胞和组织。肿瘤免疫治疗有多种治疗策略，包括非特异性免疫刺激剂、肿瘤疫苗、过继性免疫细胞疗法、单抗治疗以及免疫检查点抑制剂，而免疫检查点抑制剂在临床上显示出的高效和低毒性，更加最引人注目。(The Journal of Human Pharmacology and Drug Therapy 2016，36：317)
肿瘤免疫疗法基于“免疫编辑”的观点。(Science 2011，331：1565)个体内，肿瘤在免疫机制的控制下存在消除、平衡及逃逸三个阶段。免疫抑制可由肿瘤微环境介导，也可由肿瘤细胞自身引起。免疫检查点在此过程中发挥了重要作用。T细胞的激活，除了需要其表面受体(TCR)与APC表面的MHC I/MHC II结合，也需要其表面的CD28分子与APC表面的B7分子结合，产生共激活双信号。然而，免疫应答过程中还存在一种共抑制信号，也就是所说的免疫检查点。这类分子在T细胞被激活后表达于T细胞表面，作用模式与共激活分子类似。该机制在生理状态下被用于维持自体免疫耐受，并保护组织免受免疫应答时产生的损伤。CTLA-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4)，PD-1(Programmed cell death protein1)，TIM3(T cell membrane protein 3)，LAG3(lymphocyte activation gene 3)等都是已发现的免疫检查点。以PD-1为例，在被T细胞浸润的肿瘤组织中，激活的T细胞释放的IFN-γ等细胞因子会上调肿瘤细胞表面PD-L1(PD-1的配体)的表达。而一部分肿瘤细胞过表达这一配体从而产生过强抑制信号导致T细胞失能，达成免疫逃逸。
在PD-1/PD-L1的基础研究领域已经取得了许多重要进展，但仍存在许多待解决问题，PD-1/PD-L1转导如何抑制信号的确切机制目前尚不清楚。PD-1/PD-L1是否还有其他的相互作用的靶位仍需要进一步探究。
目前，众多的国内外知名药物公司竞相投入到PD-1/PD-L1抑制剂的研发中来，百时美施贵宝(BMS)处于绝对霸主地位，默沙东(Merck&Co)紧跟其后，而罗氏(Roche)和阿斯利康(AstraZeneca)就稍显落后。但各大公司的主要研究方向还是以单克隆抗体为主，(Drug Discovery Today21：1027)目前免疫检查点抑制剂相关的药物主要就是PD1抑制剂，PD-L1抑制剂和CTLA4抑制剂等，2011年由百时美施贵宝研发并上市的Ipilimumab，它是第一个上市的免疫检查点抑制剂，为抑制CTLA4的单克隆抗体，随后在2014年，作为两个PD-1单克隆抗体抑制剂，由百时美施贵宝研发的Nivolumab和默沙东研发的pembrolizumab分别上市，并逐步扩大适应症。2016年5月19日由罗氏研发的Atezolizumab作为二线药物用于治疗晚期膀胱癌，是第三个针对PD-1/PD-L1这个节点并阻断这个免疫抑制信号通路的药物，但这是首个PD-L1抗体。然而这些在研或者上市的PD-1/PD-L1抑制剂均是生物类药物，存在固有的制剂缺陷如经皮下注射给药的单抗类药物有可能诱导机体产生抗药抗体，从而降低药物疗效并增加副作用。单抗药物制备提纯过程复杂，因此价格昂贵，加上皮下注射，使用不便，对患者的依从性有较高要求。因此药物研发者有必要开发使用方便，口服有效的小分子类PD-1/PD-L1抑制剂来满足患者的临床需求。
总之，研制新型安全、有效的小分子类PD-1/PD-L1抑制剂具有重大临床应用价值。
根据相关专利报道的小分子PD-1/PD-L1抑制剂以及晶体结构，(Proceedings of the National Academy of Sciences 2008，105：3011)再结合计算机辅助药物设计(CADD)，我们设计了一类2-取代异烟酸类化合物，作为肿瘤免疫治疗中的免疫检查点抑制剂。
技术实现要素：
本发明公开了如式I所示的2-取代异烟酸类化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，所述式I化合物具有如下结构：
其中R1为-OR3或-NHR3；
R2为苯基、吡啶基；
R3为3～6碳的环烷基、苄基、苯基、各种取代的苯基；
R4为氢或R3与R4以-CH2CH2-N(CH3)-CH2CH2-连接；
X为氯、溴、氨基。
本发明的式I化合物优选R1为对氨基甲氧基苯基、对氨基苯氧基苯基、苄氧基、2-甲基-[1，1′-联苯]-3-胺基、3-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二恶烷-6-基)苯胺基、[1，1′-联苯]-3-胺基、3-[1，1′-联苯]-2-腈-苯胺基；优选R2为苯基、吡啶基；优选R3为对氨基苯甲酸乙酯基、对氨基苯甲酸甲酯基、对氨基三氟甲基苯基、4-甲基哌嗪基、对氨基甲氧基苯基；优选R4为氢；优选X为氯、溴、氨基。
本发明的式I化合物更优选R1为对氨基甲氧基苯基、对氨基苯氧基苯基、苄氧基、2-甲基-[1，1′-联苯]-3-胺基、3-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二恶烷-6-基)苯胺基、[1，1′-联苯]-3-胺基、3-[1，1′-联苯]-2-腈-苯胺基；更优选R2为苯基、吡啶基；更优选R3为对氨基苯甲酸乙酯基、对氨基苯甲酸甲酯基、对氨基三氟甲基苯基、4-甲基哌嗪基、对氨基甲氧基苯基；更优选R4为氢；更优选X为溴、氨基。
本发明优选的式I化合物如下：
4-((4-((4-甲氧基苯基)氨基甲酰基)-2-吡啶基)氨基)苯甲酸乙酯(I-1)；
N-(4-甲氧基苯基)-2-((3-(三氟甲基)苯基)氨基)异烟酰胺(I-2)；
N-(4-甲氧基苯基)-2-((4-甲氧基苯基；)氨基)异烟酰胺(I-3)；
2-((4-甲氧基苯基)氨基)-N-(4-苯氧基苯基)异烟酰胺(I-4)；
3-((4-(乙氧基羰基)苯基)氨基)苯甲酸乙酯(I-5)；
4-((3-((4-甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基苯甲酸乙酯(I-6)；
2-(4-甲基哌嗪基)-N-(4-苯氧基苯基)异烟酰胺(I-7)；
4-((4-((4-苯氧基苯基)氨基甲酰基)-2-吡啶基)氨基)苯甲酸乙酯(I-8)；
4-((4-((2-甲基-3-[1，1′-联苯基])氨基甲酰基)-2-吡啶基)氨基)苯甲酸乙酯(I-9)；
4-((4-((3-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二恶烷-6-基)苯基)氨基甲酰基)-2-吡啶基)氨基)苯甲酸乙酯(I-10)；
4-((4-([1，1′-联苯]-3-氨基甲酰基)-2-吡啶基)氨基)苯甲酸乙酯(I-11)；
4-((4-((2-氰基-3-[1，1′-联苯基])氨基甲酰基)-2-吡啶基)氨基)苯甲酸乙酯(I-12)；
本发明的另一个目的是提供了如式I所示2-取代异烟酸类化合物的制备方法，如下反应式：
具体包括以下步骤：
(1)式II化合物与含有R1基团的化合物缩合生成化合物III；所采用的活化试剂选自草酰氯、氯化亚砜、羰基二咪唑、氯甲酸酯、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三唑，优选羰基二咪唑；采用的溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、甲苯、1，2-二氯乙烷、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜中的一种或多种的混合溶剂，优选N，N-二甲基甲酰胺；采用的温度选自-20℃～100℃，优选30℃～70℃；
(2)式III化合物与NHR3R4以及金属钯Pd在碱性条件催化下加热发生布赫瓦尔德-哈特维希偶联反应，制得式I化合物；所采用的配体选自(±)-2，2′-双-(二苯膦基)-1，1′-联萘、2-二环己膦基-2′-(N，N-二甲胺)-联苯、4，5-双二苯基膦-9，9-二甲基氧杂蒽、2-二环己基磷-2，4，6-三异丙基联苯、1，1′-双(二苯基膦)二茂铁，优选4，5-双二苯基膦-9，9-二甲基氧杂蒽。所采用的钯选自于醋酸钯、三(二亚苄基丙酮)二钯、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)氯仿加合物，优选三(二亚苄基丙酮)二钯(0)氯仿加合物。所采用的碱性试剂选自叔丁醇钠、碳酸铯、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾，优选叔丁醇钠；采用的溶剂选自于二氧六环、DMF、DMSO、正丁醇、正戊醇、乙二醇、甲苯，优选二氧六环；采用的温度选自于50℃～200℃，优选90℃～130℃。
在上述反应式中，X、R1、R2、R3和R4的定义如式I化合物中所定义。
本发明的另一个目的是提供式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物作为免疫检查点抑制剂在疾病防治方面的用途。所述疾病包括恶性肿瘤、癌前病变或良性病变；其中所述的恶性肿瘤是实体瘤；其中所述的实体瘤选自于肺癌、皮肤癌、黑色素瘤、食管癌、膀胱癌、头颈部癌、鼻咽癌、支气管癌、乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、胆管癌、前列腺癌、脑肿瘤、结肠癌或上述实体瘤切除后的癌残留；其中所述的癌前病变选自于粘膜白斑、萎缩性胃炎、宫颈糜烂、乳腺囊性增生、老年日光性角化病、色素性干皮病或胃肠道息肉；其中所述的良性病变选自于视网膜黄斑变性、鲜红斑痣、银屑病、类风湿性关节炎、血管成形术后再狭窄、红斑狼疮皮损、类风湿性关节炎或动脉粥样硬化斑块。
本发明人通过对式I化合物的深入研究，首次发现该类化合物具有成为肿瘤免疫治疗中的免疫检查点抑制剂的潜力。尤其令人惊讶的是，2-取代异烟酸类化合物能对PD-1/PD-L1的相互作用具有一定的阻断作用。例如，通过式I化合物的均相时间分辨荧光实验中发现，式I化合物具有很好的选择性和抑制作用，因此有望开发成为更安全、有效的免疫检查点抑制剂。
本发明还提供了一种免疫检查点抑制剂的药物组合物，其中含有治疗有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物和药学上可接受的载体。所述药物组合物可以是注射剂、冻干制剂、软膏剂、搽剂、普通片剂或胶囊、缓控释片剂或胶囊、颗粒剂、散剂、糖浆剂或口服液。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实施例是为了更好的阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。
实施例1
4-((4-((4-甲氧基苯基)氨基甲酰基)-2-吡啶基)氨基)苯甲酸乙酯(I-1)的制备：
步骤一：
称取300mg的2-氨基异烟酸(II-1)(2.172mmol，1eq)于25mL圆底烧瓶中。加入4mL二氯甲烷溶解，再加入335μL的无水DMF(4.344mmol，2eq)。搅匀后，滴加370μL的草酰氯(4.344mmol，2eq)，室温搅拌30分钟，溶液成浅粉色。随后加入对甲氧基苯胺(2.606mmol，1.2eq)，并于室温下搅拌1.5小时，溶液呈浅棕色并有白烟生成。冰浴中加入525μL的吡啶(6.516mmol，3eq)和2mL的二氯甲烷，随后在室温下搅拌30分钟，溶液变成黑色后又变成橘黄色，有气泡生成。旋干溶剂后得浅红色固体，向其中加入5mL的乙醇和655μL的乙二胺(9.774mmol，4.5eq)，加热并回流30分钟。TLC检测反应完毕后，停止加热，冷却后直接抽滤，用水与乙醚多次清洗滤饼，红外灯下烘干，得399mg淡黄色固体，2-氨基-N-(4-甲氧基苯基)异烟酰胺(III-1)，收率75.5％。
步骤二：
称取80mg的2-氨基-N-(4-甲氧基苯基)异烟酰胺(III-1)(0.3289mmol，1.1eq)，51μL的对碘苯甲酸甲酯(0.2990mmol，1eq)，3.404mg的三(二亚苄基丙酮)二钯-氯仿加合物(0.003289mmol，1％eq)，15.22mg的4，5-双二苯基膦-9，9-二甲基氧杂蒽(0.0263mmol，8％eq)，63.21mg的叔丁醇钠(0.6578mmol，2eq)于25mL的史莱克管中，加入3mL的无水甲苯，置换氩气，回流24后，待反应完毕，停止加热并冷却，分出有机相，水相用乙酸乙酯萃取(25mL x 3)，合并有机相，依次水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。旋干硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝25∶1)分出10.6m g的淡黄色固体4-((4-((4-甲氧基苯基)氨基甲酰基)-2-吡啶基)氨基)苯甲酸乙酯(I-1)，产率9.1％。1H NMR(300MHz，DMSO-d)δ10.30(s，1H)，9.76(s，1H)，8.39(d，J＝3Hz，1H)，7.95-7.80(m，4H)，7.67(d，J＝6Hz，2H)，7.37(s，1H)，7.32(d，J＝6Hz，1H)，6.95(d，J＝9Hz，2H)，4.31-4.23(m，2H)，3.75(s，3H)，1.34-1.29(t，J＝15Hz，3H)；ESI MS m/z 430.2[M+K]+.
实施例2
N-(4-甲氧基苯基)-2-((3-(三氟甲基)苯基)氨基)异烟酰胺(I-2)的制备
步骤一：
将1g的2-氯异烟酸(6.347mmol，1.1eq)(II-2)溶于10mL的无水DMF中，再加入1.1227g的N，N’-羰基二咪唑(6.924mmol，1.2eq)，并于70℃下加热1h。随后加入711mg的对甲氧基苯胺(5.7701mmol，1eq)，于70℃下反应12h。TLC检测反应完毕后，停止加热，待反应冷却后，水洗除去DMF，再用乙酸乙酯反复萃取(20mL x 5)，合并有机相，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。旋干后硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝15∶1)分出714.9mg的淡黄色固体2-氯-N-(4-甲氧基苯基)异烟酰胺(III-2)，产率42.9％。
步骤二：
称取100mg的2-氯-N-(4-甲氧基苯基)异烟酰胺(III-2)(0.3807mmol，1eq)，47μL的间三氟甲基苯胺(0.3807mmol，1eq)，4.2743mg的醋酸钯(0.01904mmol，5％eq)，22.03mg的4，5-双二苯基膦-9，9-二甲基氧杂蒽(0.03807mmol，10％eq)，248.08mg的碳酸铯(0.7614mmol，2eq)于25mL的史莱克管中，加入3mL的无水二氧六环，置换氩气，回流24后，待反应完毕，停止加热并冷却，分出有机相，水相用乙酸乙酯萃取(25mL x 3)，合并有机相，依次水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。旋干硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)分出5.3m g的淡黄色固体N-(4-甲氧基苯基)-2-((3-(三氟甲基)苯基)氨基)异烟酰胺(I-2)，产率3.6％。1H NMR(300MHz，DMSO-d)δ10.27(s，1H)，9.64(s，1H)，8.33(d，J＝3Hz，1H)，8.23(s，1H)，7.85(d，J＝6Hz，1H)，7.62(d，J＝9Hz，2H)，7.46(t，J＝15Hz，1H)，7.29-7.13(m，3H)，6.90(d，J＝9Hz，2H)，3.70(s，3H)；ESI MS m/z 386.1[M-H]-.
实施例3
N-(4-甲氧基苯基)-2-((4-甲氧基苯基)氨基)异烟酰胺(I-3)的制备
反应步骤参照实施例2，得到2.3mg的黄色固体N-(4-甲氧基苯基)-2-((4-甲氧基苯基)氨基)异烟酰胺(I-3)，收率3.4％。1H NMR(300MHz，DMSO-d)δ10.21(s，1H)，9.02(s，1H)，8.23(d，J＝6Hz，1H)，7.65(d，J＝9Hz，2H)，7.56(d，J＝9Hz，2H)，7.16(s，1H)，7.11(d，J＝6Hz，1H)，6.91(dd，J＝15，9Hz，4H)，3.74(d，J＝6Hz，6H)；ESI MS m/z 372.1[M+Na]+.
实施例4
2-((4-甲氧基苯基)氨基)-N-(4-苯氧基苯基)异烟酰胺(I-4)的制备
反应步骤参照实施例2，得到12.5mg黄色的固体2-((4-甲氧基苯基)氨基)-N-(4-苯氧基苯基)异烟酰胺(I-4)，收率9.2％。1H NMR(500MHz，DMSO-d)δ10.36(s，1H)，9.03(s，1H)，8.24(d，J＝5Hz，1H)，7.77(d，J＝10Hz，2H)，7.56(d，J＝10Hz，2H)，7.38(t，J＝15Hz，2H)，7.18(s，1H)，7.14-7.11(m，2H)，7.04(d，J＝10Hz，2H)，7.00(d，J＝10Hz，2H)，6.89(d，J＝10Hz，2H)，3.73(s，3H)；ESI MS m/z 410.4[M-H]-；
实施例5
3-((4-(乙氧基羰基)苯基)氨基)苯甲酸乙酯(I-5)的制备
步骤一：
分别称取300mg的间溴苯甲酸(II-5)(1.4924mmol，1eq)，412.5mg的K2CO3(2.9848mmol，2eq)，加入到25mL的史莱克管，溶于3mL的无水DMF中，待其搅匀后，滴加200μL的溴化苄(1.6416mmol，1.1eq)，升温至100℃回流24h。停止加热，待反应冷却后，滤液分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取三遍(20mL x 3)，合并有机相，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。蒸干柱层析(石油醚)得到422mg的半透明油状物3-苄基溴苯(III-5)，收率97.1％。
步骤二：
反应步骤参照实施例2，得到87.1mg的白色固体3-((4-(乙氧基羰基)苯基)氨基)苯甲酸乙酯(I-5)，收率23％。1H NMR(300MHz，DMSO-d)δ9.01(s，1H)，7.82(d，J＝6Hz，2H)，7.73(s，1H)，7.60-7.47(m，1H)，7.51-7.27(m，7H)，7.10-7.06(m，2H)，5.32(s，2H)，4.22(q，J＝6Hz，2H)，1.26(t，J＝6Hz，3H)；ESI MS m/z 398.1[M+Na]+.
实施例6
4-((3-((4-甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基苯甲酸乙酯(I-6)的制备
步骤一：
分别称取301.8mg的3-((4-(乙氧基羰基)苯基)氨基)苯甲酸乙酯(I-5)(0.8039mmol，1eq)，质量分数10％的Pd-C，溶于3mL异丙醇和3mL四氢呋喃的混合溶剂中。待其搅匀后，置换氢气并于室温下反应12h。用硅藻土抽滤除去Pd-C，蒸干柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝15∶1)得到95.4mg的白色的固体3-((4-(乙氧基羰基)苯基)氨基)苯甲酸(IV-6)，收率41.6％。
步骤二：
将75.4mg的3-((4-(乙氧基羰基)苯基)氨基)苯甲酸(IV-6)溶于5mL的无水DCM中，加入70μL的DIPEA(0.3977mmol，1.5eq)使其完全溶解，待搅匀后分批加入HATU(0.3977mmol，1.5eq)，于室温搅拌一个小时后，加入对甲氧基苯胺并升温至50℃反应12h。停止加热，滤液分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取三遍(20mL x 3)，合并有机相，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。蒸干柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝800∶1)得到23.6m g的白色固体4-((3-((4-甲氧基苯基)氨基甲酰基)苯基)氨基苯甲酸乙酯(I-6)，收率22.8％。1H NMR(300MHz，DMSO-d)δ10.09(s，1H)，8.94(s，1H)，7.84(d，J＝8.4Hz，2H)，7.72(s，1H)，7.67(d，J＝8.5Hz，2H)，7.55(d，J＝7.5Hz，1H)，7.46(t，J＝7.8Hz，1H)，7.37(d，J＝8.1Hz，1H)，7.13(d，J＝8.4Hz，2H)，6.93(d，J＝8.7Hz，2H)，4.31-4.19(m，2H)，3.75(s，3H)，1.30(t，J＝7.1Hz，3H)；ESI MS m/z 413.2[M+Na]+.
实施例7
2-(4-甲基哌嗪基)-N-(4-苯氧基苯基)异烟酰胺(I-7)的制备
反应步骤参照实施例2，得到28.6mg的油状物2-(4-甲基哌嗪基)-N-(4-苯氧基苯基)异烟酰胺(I-7)，产率7％。1H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ8.55(s，1H)，8.16(d，J＝5.1Hz，1H)，7.58(d，J＝8.7Hz，2H)，7.28-7.14(m，2H)，7.09(s，1H)，7.00(t，J＝7.5Hz，1H)，6.95-6.84(m，5H)，3.65(s，4H)，2.62(t，J＝5.1Hz，4H)，2.38(s，3H)；ESI MS m/z 389.2[M+H]+.
实施例8
4-((4-((4-苯氧基苯基)氨基甲酰基)-2-吡啶基)氨基)苯甲酸乙酯(I-8)的制备
反应步骤参照实施例2，得到6.8mg的油状物4-((4-((4-苯氧基苯基)氨基甲酰基)-2-吡啶基)氨基)苯甲酸乙酯(I-8)，产率5％。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ10.45(s，1H)，9.77(s，1H)，8.39(d，J＝5.4Hz，1H)，7.86(d，J＝3.7Hz，4H)，7.77(d，J＝8.7Hz，2H)，7.41-7.28(m，4H)，7.15-6.94(m，5H)，3.80(s，3H)；ESI MS m/z 462.2[M+Na]+.
实施例9
4-((4-((2-甲基-3-[1，1′-联苯基])氨基甲酰基)-2-吡啶基)氨基)苯甲酸乙酯(I-9)的制备
步骤一：
称取548.7mg的苯硼酸(4.5mmol，1.5eq)，360μL的3-氯-2-甲基苯胺(3mmol，1eq)，磷酸钾1.9g(9mmol，3eq)，31mg的三(二亚苄基丙酮)二钯(0.03mmol，1％eq)，114.4mg的2-二环己基磷-2，4，6-三异丙基联苯(0.24mmol，8％eq)，加入到史莱克管中，以适量二氧六环溶解，液氮冷冻后于双排管置换Ar五分钟以上。110℃回流8小时。以1N盐酸淬灭反应。乙酸乙酯/水萃取，合并有机相。旋转蒸发得褐色油状粗品。以石油醚∶乙酸乙酯＝20∶1进行柱层析，得到545.4mg的浅黄色固体2-甲基-[1，1′-联苯]-3-胺(V-9)，收率为99.2％。
步骤二：
称取100mg的2-氨基异烟酸(0.495mmol，1eq)以2mL无水二氯甲烷溶解于圆底烧瓶中，加入123μL的DIPEA(0.7425mmol，1.5eq)，体系变澄清，再加入282.3mg的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(0.745mmol，1.5eq)，溶液逐渐变黄且出现浑浊。活化1h。向体系加入90.4mg的2-甲基-[1，1′-联苯]-3-胺(V-9)(0.495mmol，1eq)。反应过夜，以乙酸乙酯/水萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥后于旋转蒸发仪浓缩，以石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1进行柱层析，得到123.5mg的白色固体2-溴-N-(2-甲基-[1，1′-联苯]-3-)异烟酰胺(III-9)，收率为67.9％。
步骤三：
称取123.5mg的2-溴-N-(2-甲基-[1，1′-联苯]-3-)异烟酰胺(III-9)(0.34mmol，1eq)，61.1mg的对氨基苯甲酸乙酯(0.37mmol，1.1eq)，49mg的叔丁醇钠(0.51mmol，1.5eq)，3.5mg的三(二亚苄基丙酮)二钯(0.0034mmol，1％eq)，13mg的2-二环己基磷-2，4，6-三异丙基联苯(0.0272mmol，8％eq)，加入到史莱克管中，以适量二氧六环溶解，液氮冷冻后于双排管置换Ar五分钟以上。110℃回流8小时。以1N盐酸淬灭反应。乙酸乙酯/水萃取，合并有机相，旋转蒸发浓缩后，以石油醚∶丙酮＝1.5∶1(0.5％三乙胺)进行柱层析。得到6.1mg的白色固体4-((4-((2-甲基-3-[1，1′-联苯基])氨基甲酰基)-2-吡啶基)氨基)苯甲酸乙酯(I-9)，收率为3.9％。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ10.17(s，1H)，9.79(s，1H)，8.41(d，J＝5.3Hz，1H)，7.95-7.80(m，4H)，7.54-7.34(m，4H)，7.40-7.25(m，5H)，7.16(d，J＝7.4Hz，1H)，4.28(q，J＝7.1Hz，2H)，2.12(s，3H)，1.31(t，J＝7.1Hz，3H).ESI MS m/z 452.2[M+H]+.
实施例10
4-((4-((3-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二恶烷-6-基)苯基)氨基甲酰基)-2-吡啶基)氨基)苯甲酸乙酯(I-10)的制备
合成过程参考实例9。得到33.7mg的白色固体4-((4-((3-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二恶烷-6-基)苯基)氨基甲酰基)-2-吡啶基)氨基)苯甲酸乙酯(I-10)，收率为10.2％。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ10.51(s，1H)，9.84(s，1H)，8.03(s，1H)，7.91(q，J＝8.6Hz，4H)，7.78(d，J＝8.0Hz，1H)，7.44(t，J＝7.5Hz，2H)，7.39(t，J＝8Hz，2H)，7.15(d，J＝7.2Hz，2H)，7.02-6.96(m，1H)，4.33-4.28(m，6H)1.34(dd，J＝7.9，J＝6.4Hz，3H).ESI MS m/z 456.2[M+H]+.
实施例11
4-((4-([1，1′-联苯]-3-氨基甲酰基)-2-吡啶基)氨基)苯甲酸乙酯(I-11)的制备
合成方法参考实例9。得到81.9mg的白色泛黄粉末4-((4-([1，1′-联苯]-3-氨基甲酰基)-2-吡啶基)氨基)苯甲酸乙酯(I-11)，收率为17.5％。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ10.55(s，1H)，9.83(s，1H)，8.46(d，J＝5.3Hz，1H)，8.12(s，1H)，7.91(q，J＝8.7Hz，4H)，7.83(d，J＝7.9Hz，1H)，7.68(d，J＝7.7Hz，2H)，7.57-7.44(m，4H)，7.45-7.36(m，3H)，4.31(q，J＝7.1Hz，2H)，1.34(t，J＝7.1Hz，3H).ESI MS m/z 438.2[M+H]+.
实施例12
4-((4-((2-氰基-3-[1，1′-联苯基])氨基甲酰基)-2-吡啶基)氨基)苯甲酸乙酯(I-12)的制备
合成方法参考实例9。得到68.9mg的白色固体4-((4-((2-氰基-3-[1，1′-联苯基])氨基甲酰基)-2-吡啶基)氨基)苯甲酸乙酯(I-12)，收率为15.1％。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ10.89(s，1H)，9.86(s，1H)，8.49(d，J＝5.2Hz，1H)，7.96-7.85(m，4H)，7.85(d，J＝8.1Hz，1H)，7.67(d，J＝8.0Hz，1H)，7.66-7.53(m，6H)，7.48(s，1H)，7.42-7.37(m，1H)，4.31(q，J＝7.4Hz，2H)，1.34(dd，J＝8.2，J＝5.6Hz，3H).ESI MS m/z 463.2[M+H]+.
实施例13
式I化合物作为免疫检查点抑制剂的蛋白水平评价
1、实验目的：检测式I化合物作为免疫检查点抑制剂，对于PD-1/PD-L1的相互作用的抑制效果。
2、实验材料：384孔细胞培养板购自Nunc公司；均相时间分辨荧光Homogeneous Time-Resolved Fluorescence(HTRF)试剂盒购自Cisbio公司；DMSO购自Sigma公司。
3、实验仪器：Perkin Elmer EnVision多功能酶标检测仪。
4、受试药物：式I化合物。样品用DMSO配制成母液使用，使用时用diluent buffer稀释使用，DMSO终浓度不超过0.1％。
5、实验方案：蛋白抑制试验采用HTRF试剂盒。设立阴性对照组，阳性对照组，药物组，每组3个复孔；向384孔板加入2μL的经diluent buffer稀释的受试药物(终浓度为10μM)。随后每孔各加入4μL的经diluent buffer稀释的Tag1-PD-L1和Tag2-PD1，于37℃下孵育15分钟后，再向每孔加入5μL的经detection buffer稀释的anti-Tag1-Eu3+和anti-Tag2-XL665。于37℃下孵育1小时至24小时后，用Perkin Elmer Envision多功能酶标检测仪测定在665nm和620nm处的荧光值，采用GraphPad Prism 7软件计算出抑制率。
6、实验结果：式I化合物作为免疫检查点抑制剂，对于PD-1/PD-L1的相互作用的抑制效果见下表：
实验结果表明，2-取代异烟酸类化合物作为肿瘤免疫治疗中的免疫检查点抑制剂对于PD-1/PD-L1的相互作用具有一定的抑制效果，尤其是I-2、I-4、I-5、I-7等化合物。因此从以上均相时间分辨荧光实验测试的结果来看，式I化合物具有成为肿瘤免疫治疗中的免疫检查点抑制剂的潜力。尤其重要的是，本发明化合物具有很好的选择性和新颖性，因此有望开发成为更安全、有效的免疫检查点抑制剂。
实施例14
片剂
将实施例1中制得的化合物I-1(50g)、羟丙甲基纤维素E(150g)、淀粉(200g)、聚维酮K30适量和硬脂酸镁(1g)混合，制粒，压片。