基于负载了天然杀伤t细胞的配体、和抗原的b细胞的疫苗的制作方法

专利名称：基于负载了天然杀伤t细胞的配体、和抗原的b细胞的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预防和治疗传染病和癌症的基于B细胞的疫苗，所述 B细胞负载了天然杀伤T细胞的配体，和抗原，更准确地，由负载了 oi-半乳糖基神经酰胺和抗原的B细胞介导的免疫治疗和预防疫苗，所述cc-半乳糖基神经酰胺是一种能够刺激天然杀伤T细胞的糖脂。
背景技术：
通常，肿瘤抗原不能由抗原呈递细胞有效地呈递，即，不能有效地诱 导免疫应答。抗肿瘤疫苗是新型治疗性疫苗，其特征在于活化肿瘤特异性 免疫系统(例如，向抗原呈递细胞引入肿瘤抗原)，从而诱导强烈的免疫 应答，以破坏癌细胞。
在可利用的疫苗方法中，已知利用抗原呈递细胞(APC)诸如树突细 胞(DC)的细胞疫苗可靠地生成有效的T细胞免疫性(Rosenberg, S. A. 等，自然医学(Nat.Med.) ,10,909-915,2004)。因为已经表明特别是基于 DC的疫苗有效诱导Ag-特异性效应器和记忆T细胞，所以在大量临床试 验中认为它们是抗肿瘤免疫疗法(Rosenberg, S. A.等，自然医学(Nat. Med.): 10, 909-915, 2004)。树突细胞对免疫疗法而言是理想的抗原-呈递细胞 (APC)，因为它们能够捕获Ag并然后迁移到淋巴器官内，在那里它们向 相关的T细胞呈递所述Ag。更重要地，它们提供对T细胞的强烈共刺激 (Figdor, C. G等，自然医学(Nat. Med.) , 10， 475-480， 2004;和Banchereau, J. 等，细胞(Cell) ，106,271-274,2001)。针对试验和临床研究充分地确定了 DC-疫苗方法。然而，DC在血液和淋巴组织中相对稀少，且很难先体外 后体内地从血液单核细胞增多它们的数量，这两点均体现处它们在疫苗中 的普遍应用的主要缺点(Schultze， J.L.等，免疫学趋势(Trends Immunol.), 25, 659-664, 2004)。B细胞为细胞疫苗提供了有吸引力的备选来源，原因在于它们在淋巴
组织和血液中丰富，并易于先体外后体内地扩大(Schultze，J.L.等，免疫学 趋势(Trends Immunol.) ， 25， 659-664， 2004; von Bergwelt-Baildon, M.S.等， 血液(Blood) ， 99, 3319-3325， 2002;和Schultze， J. L.等，临床研究杂志(J. Cin. Invest.) ， 100， 2757-2757， 1997)，并且在肠胃外施用后返回到淋巴器官。
尽管这些优势，并没有将B细胞考虑作为细胞疫苗的来源，原因在于 它们的免疫原性很低。事实上，累积的证据显示可能是由于缺乏共刺激， 它们在CD4和CD8T细胞中直接诱导免疫耐受性(Bennett, S. R.等，试验 医学杂志(J. Exp. Med.) , 188, 1977-1983, 1998;和Eynon, E. E.等，试验医 学杂志(J,Exp.Med.) ， 175, 131-138， 1992)。然而，'活化的'B细胞能够 使CD4和CD8T细胞致敏(von Bergwelt-Baildon, M. S.等，血液(Blood)， 99, 3319-3325, 2002; Schultze, J. L.等，临床研究杂志(J. Clin. Invest) , 100, 2757-2765， 1997; Lapointe, R.等，癌症研究(Cancer Res.) ,63,2836-2843, 2003;和Heit，A.等，免疫学杂志(J. Immunol.) ,172,1501-1507,2004)，这 提示，当通过适当的刺激物激活B细胞时，其可以作用为能够诱导Ag-特 异性T细胞免疫性的APC的作用。
充分确定地，总体上，zTSTKT细胞在多种免疫应答和免疫病理学中扮 演至关重要的角色。尽管它们在小鼠中代表少于1%的淋巴细胞，但是 WKT细胞控制针对自体-和外源-Ag的应答，并决定是否诱导耐受性或免 疫性(Kronenberg, M.,免疫性年度综述(Annu. Rev. Immunol.), 23， 877-900, 2005;禾口 Park, S. H. & Bendelac， A.，自然(Nature) ，406,788-792,2000)。 它们在肿瘤、糖尿病中和免疫-专用位点处起到免疫性抑制子的作用 (Sonoda， K. H.，等,试验医学杂志(J. Exp. Med.) ，190,1215-1226,1999)。
相反，配体-介导的z"NKT细胞活化导致T、 B和NK细胞以及DC的 活化。注射aGalCer，即一种/NKT配体，通过调控NK和T细胞产生抗 肿瘤免疫性(Moodycliffe, A. M.,等，自然免疫性(Nat. Immunol.), 1, 521-525, 2000)。
a-半乳糖基神经酰胺(ccGalCer)是一种从海洋海绵体中提取的糖脂， 它是天然杀伤T细胞的配体，并由在抗原呈递细胞(APC)上的CDld呈递，
5所述天然杀伤T细胞具有Val4+ T细胞受体(TCR) (K證ano等，科学 (Science) ，278: 1626， 1997)。天然杀伤T细胞的活化导致IFN-y和IL-4 的大规模产生，由此能够控制针对传染病或癌症的免疫应答(Chen等，免 疫学杂志(J. Immunol.)) , 159: 2240， 1997; Wilson等，美国国家科学院学 报(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.) ，100:10913,2003)。
共施用了蛋白质Ag和oiGalCer的小鼠发展了体液的和细胞-介导的免 疫性，其包括细胞毒性T细胞应答(Hermans， I. F.,等，免疫学杂志(J. Immunol), 171, 5140-5147, 2003;和Stober， D.等，免疫学杂志(J. Immunol), 170,2540-2548,2003)。此外，近期的研究己经证明了负载aGalCer的DC 比游离形式的aGalCer产生更长期-持久的/NKT细胞应答，这提示/NKT-配体的辅助作用(adjuvancity)能够通过将其靶定到专门的APC上得到增 强。
本发明人证实了 zmT-配体在B细胞上的呈递能够将它们从耐受原性 转变为免疫原性，由此产生针对展示在B细胞MHC分子上的Ag的强烈 免疫性。为了验证该证实，并由此完成本发明，本发明人进一步证实了负 载aGalCer的、肽-脉冲的B细胞和负载aGalCer的、腺病毒-转导的B细 胞在生成抗原特异性免疫性和抗-肿瘤活性中的功效。
内容
技术问题
本发明的目的是提供免疫治疗/预防疫苗和抗肿瘤疫苗，所述疫苗能够 诱导抗原-呈递B细胞-介导的抗原-特异性免疫应答。受到负载抗原的B 细胞的CDld分子上的aGalCer刺激的天然杀伤T细胞将耐受原性的B细 胞转变免疫原性的抗原呈递细胞。
技术方案
本发明提供由B细胞介导的免疫治疗/预防性疫苗和抗肿瘤疫苗，所 述B细胞负载了天然杀伤T细胞的配体，和抗原。
本发明还提供由B细胞介导的抗肿瘤疫苗，所述B细胞负载了天然杀 伤T细胞的配体并表达肿瘤抗原。本发明进一步提供由负载aGalCer的B细胞介导的天然杀伤T细胞激 活剂。
另外，本发明提供由表达肿瘤抗原的B细胞介导的细胞毒性反应诱导物。
以下，详述本发明
本发明提供由B细胞介导的免疫治疗/预防性疫苗和抗肿瘤疫苗，所 述B细胞负载了单独的天然杀伤T细胞的配体，或还负载了抗原。
天然杀伤T细胞的配体包括下述源自鞘氨醇单胞菌属亚种 (Sphingomonas spp.) 的 a-galacturonosylceramide 禾口 a-glucuronosylceramide (Mattner， J.等自然(Nature)434:525, 2005, Kinjo, Y. 等自然(Nature) 434:520,2005)，源自结核分枝杆菌(M. tuberculosis) 的磷脂酰肌醇四甘露糖苷(Fischer,K.等PNAS 101:10685, 2004)，自体抗原 异球三己糖基神经酰胺(Zhou,D.等科学(Science) 306:1786, 2004)和神经 节苷脂GD3 (Wu， D. Y.等试验医学杂志(J. Exp. Med.) 198:173,2003)， 磷脂酰胆碱(免疫学杂志(J. Immunol.) 175:977,2005)， (3-半乳糖基神经酰 胺(卩GalCer，Ortaldo JR等，免疫学杂志(J. Immunol.) 172:943),利什曼 表面糖苷键脂磷酸聚糖和糖基肌醇磷脂(glycoinositol phospholipid)(试验 医学杂志(J. Exp. Med.) 200:895, 2004)， aGalCer衍生物(3-异头GalCer 和a-异头GalCer(免疫学杂志(J. Immunol.) 173:3693,2004)， aGalCer变 体(美国化学协会杂志(J.Am.Chem. Soc.) 126:13602, 2004)和细菌脂质抗 原诸如源自皮诺卡氏菌(Nocardia falcinica)的葡萄糖单霉菌酸酯(Moody, D. B.等试验医学杂志(J. Exp. Med.) 192:965,2000)。
由于己经充分确定了负载aGalCer的DC激活z'NKT细胞(van der Vliet HJ,等，免疫学方法杂志(J Immunol Methods.) , l;247(l-2):61-72, 2001)， 本发明人检查了负载aGalCer的B细胞是否也同样作用。
从小鼠中分离0(:和0019+ B细胞(

图1)。每个细胞用不同浓度的 aGalCer脉冲，再与NKT杂交瘤共培养。然后，测量了培养上清液中的IL-2 水平。作为结果，负载aGalCer的B细胞(B/ aGalCer)和负载aGalCer的 DC (DC/ aGalCer)刺激NKT杂交瘤产生IL-2 (见图30)。因此，证实了 B/aGalCer和DC/aGalCer能够先体外后体内地激活/NKT细胞。为了研究体内施用的B/aGalCer和DC/aGalCer是否能够激活免疫细 胞，本发明人将来自小鼠的B/aGalCer或DC/aGalCer静脉内注射到同种 小鼠中，并通过ELISPOT测量IL-4-和IFN-y-生成细胞的水平。具体地， 对野生型C57BL/6或Ja281-a小鼠静脉内注射了赋形剂赋形剂、aGalCer、 负载aGalCer的B细胞或负载aGalCer的DC。 一周后，分离脾细胞，制 备单细胞，将其置于ELISPOT平板上。将赋形剂或aGalCer添加到该平 板上，随后培养6小时用于进行刺激。按照供应商的说明(IL-4 ELISPOT 试剂盒，IFN-y ELISPOT试剂盒；R&D系统(R&D system))进行ELISPOT 测定，从而测量分泌IL-4和IFN-y的细胞。
作为结果，注射B/aGalCer和DC/aGalCer都诱导大量IL-4和IFN-y-生成细胞(图2)。然而，应该注意，甚至在缺乏(xGalCer再刺激的条件下， 检测出显著量的该细胞因子-生成细胞。然而，本发明人认为IL-4-和IFN-y-生成细胞的诱导依赖于/NKT细胞，因为它不发生在缺乏/NKT群的 Ja 281-/-小鼠中(见图2)。
本发明人将CFSE (羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯)标记的B/aGalCer 静脉内施用到首次用于实验的小鼠中，并且然后，在施药后24或48小时 的时候，本发明人通过流式细胞计数法分析了在CFSE+细胞上的共刺激分 子，从而确定如果注射后，在负载aGalCer的B细胞中诱导了任何改变将 会怎么样。作为结果，24小时内诱导了高水平的CD86而非CD80的表达 (图3)。 CD40和MHCII也受到轻微的上调。总之，体内施用B/aGalCer 在24或48小时内诱导B细胞的活化。
其次，本发明人阐释aGalCer和MHC I-限制的肽在B细胞上的共脉 冲是否能够使肽-特异性CD8+T细胞致敏。为了该目的，本发明人首先适 当地将CFSE-标记的OVA-特异性CD8+T细胞移植到小鼠中，然后施用赋 形剂-脉冲的B细胞(单独的B细胞)、aGalCer-脉冲的B细胞(BAxGalCer)、 赋形剂+肽-脉冲的B细胞(B/pep)或aGalCer +肽-脉冲的B细胞 (B/otGalCer/pep)。然后，从脾和淋巴结获得淋巴细胞，随后在移植了B细 胞的小鼠中测量CD8+T细胞应答。作为结果，在接受单独的B的小鼠中 几乎没有诱导OVA-特异性CD8+T细胞的分裂；然而，在BAxGalCer组中 注意到OVA-特异性CD8+T细胞的弱分裂，其可能具有Ag-非特异性起源。注射B/pep诱导了 OVA-特异性CD8+T细胞的大量分裂。且被给予 B/aGalCer/pep的小鼠显示出增强的CD8+T细胞分裂，其中多于40%的由 此生成的细胞产生IL-2，且最令人惊讶地，多于卯％的由此生成的细胞以 比B/pep组高得多的水平产生IFN-Y (见图4)。这些结果提示高得多的 CD8+ T细胞活化率能够通过将aGalCer负载到B/pep上而实现。
本发明人研究了基于B细胞的疫苗方法是否能够诱导细胞毒性免疫 性。具体地，本发明人用单独的B、 B/aGalCer、 B/pep或B/aGalCer/pep 静脉内注射C57BL/6小鼠组，并且然后在体内确定CTL活性。作为结果， 仅B/aGalCer/pep完全裂解肽-脉冲的耙标(图5)。且B/aGalCer/pep-处理 的组在针对所述肽的生产IFN- Y的CD8+ T细胞的数量上，显示出显著的 增加(图6，左图)。当用OVA-包被的同源脾细胞进行后继免疫作用以描 绘CTL反应性时，被给予单独的B或BAxGalCer的小鼠针对致敏正常应 答，并产生大量的肽-特异性生产正仆￥的008+ T细胞(图6，右图)。 然而，当用相关的肽在体外再刺激来自于B/pep免疫的小鼠脾细胞时，与 注射了单独的B的小鼠的那些相比，生产IFN-Y的CD8+T细胞的数量减 少，这提示那些小鼠耐受所述肽。相反，用B/aGalCer/pep接种的小鼠获 得了比接受了 B/aGalCer或单独的B的组所获得的多得多数量的肽-反应 性CD8+T细胞，这提示这是记忆性应答。
本发明人比较了基于B细胞的疫苗方法和DC疫苗方法在产生细胞毒 性上的功效。为了该目的，本发明人确定了在体内获得完全的靶细胞裂解 所需要的最少细胞数量。鉴于DC的表面积比B细胞的表面积大得多， B/aGalCer/pep在产生细胞毒性中与DC/aGalCer/pep —样有效。同时， DC/pep-处理的组的体内细胞毒性的模式与DC/aGalCer/pep-处理的组的非 常类似，这说明将aGalCer负载到DC上没有进一步增强DC/pep疫苗功 效。
本发明人接下来检查了哪些类型的免疫细胞参与CTL应答的产生。为 了该目的，在用B/aGalCer/pep接种小鼠之前4天或之后4天，本发明人 用消耗的Ab注射它们，并然后进行体内CTL测定。作为结果，不考虑消 耗的时间，CTL活性的产生不受CD4+消耗或NKl.l+细胞消耗的妨碍。在 另一方面，CD8消耗完全阻断了靶细胞的杀伤(图9)。
9可以争论的是，肽-脉冲的B细胞不起APC的作用，而起肽储存库的 作用，宿主DC从其中取出肽，从而诱导CTL应答。为了探究这种可能性， 本发明人使用了 bm-l小鼠。这些小鼠的细胞能够将OVA肽负载到它们的 MHCI类分子上，但是由此生成的复合物由于在H-2K区域中的突变，不 被同族CD8+T细胞识别。来自该品系的B细胞正常表达CDld，并对 aGalCer作出应答从而刺激/NKT的活化，这说明B和z皿T之间的相互 作用是完好无损的。此外，当利用来自野生型小鼠的B细胞制备 BAxGalCer/pep，并然后将其注射到野生型小鼠中时，产生了完整的体内 OVA-特异性细胞毒性。然而，当将来源自bm-l小鼠B细胞的 B/aGalCer/pep注射到野生型小鼠中时，未能产生OVA-特异性细胞裂解活 性，这提示在受体小鼠中的DC或其他专门的APC不负责CTL的产生(图 11)。
本发明接下来检查了当分别脉冲(xGalCer和肽并然后一起注射时，是 否可能产生CTL。作为结果，用'B/aGalCer加B/pep'接种的小鼠未能产生 体内的细胞毒性(图12)。该结果证明为了产生OVA-特异性细胞毒性， 肽和aGalCer必须在相同的B细胞上呈递。
本发明人还研究了用B/aGalCer/pep接种是否产生抗-肿瘤免疫性。为 了测试预防性抗-肿瘤活性，在将OVA-转染的黑素瘤皮下移植到小鼠组中 之前，用单独的B、 B/aGalCer、 B/pep 、 B/aGalCer/pep 、 DC/pep或 DC/aGalCer/pep对它们接种一次。作为结果，尽管所有的小鼠最后都发育 了肿瘤，在用B/aGalCer接种的小鼠中观察到了稍微延迟的肿瘤生长模式。 相反，接受了 B/aGalCer/pep、 DC/pep或DC/aGalCer/pep的小鼠没有发育 肿瘤(见图13)。为了检査这些小鼠是否建立了长期的抗-肿瘤活性，本发 明人在第一次肿瘤接种后70天时，用相同的肿瘤细胞再次攻击了存活的 无肿瘤小鼠。本发明人在那些小鼠中没观察到肿瘤生长，这证明用 B/otGalCer/pep接种引起了针对所述肿瘤的记忆免疫性(见图14)。
下一步，本发明检查了用B/txGalCer/pep接种是否根除预先-存在的肿 瘤。作为结果，在用DC/pep、 DC/aGalCer/pep或B/aGalCer/pep接种的小 鼠中，完全抑制了肿瘤的生长(见图15和图16)。
为了确定这种基于B细胞的疫苗方案是否能够应用到真正的肿瘤Ag中，本发明人选择了 Her-2/^"模型。本发明人在被给予负载otGalCer的、 Her-2Mw 63.71-脉冲的B细胞的小鼠中体内观察到显著水平的Her-2/^w-特 异性细胞毒性(见图17)。为了检查在该模型中的治疗性抗肿瘤活性，本 发明人在用负载aGalCer的、Her-2/"e" 63_71-脉冲的B细胞接种小鼠前，向 它们注射表达Her-2/"w的肿瘤细胞。肿瘤接种后，用BAxGalCer或B/pep 接种的那些小鼠的存活率比用单独的B接种的那些稍好(见图18)。相反， 用B/ccGalCer/pep接种的全部小鼠在该试验过程中始终存活。在实体瘤模 型中，用基于B细胞的疫苗或基于DC的疫苗接种移植了肿瘤的小鼠。作 为结果，用负载aGalCer的、Her-2/"ew 63.71-脉冲的B细胞接种的小鼠中肿 瘤细胞生长的抑制与用DC疫苗接种的小鼠中的差不多(见图19)。
因此，证明了本发明的基于B细胞的疫苗在产生预防性和治疗性抗肿 瘤免疫性中与基于DC的疫苗一样有效。
本发明还提供由B细胞介导的免疫治疗/预防性疫苗和抗肿瘤疫苗， 所述B细胞负载了天然杀伤T细胞的配体并表达抗原。
与肽-脉冲的细胞疫苗不同，由病毒载体转导从而表达完整抗原的细胞 疫苗能够在不受关于主要组织相容性复合体单元型的限制下，应用于每个 人，并能够同时诱导不同的表位4寺异性免疫应答，特别是体液免疫应答和 细胞-介导的免疫应答。用腺病毒(AdHM)转导B细胞，所述腺病毒具有 编码Her-2/"w，即肿瘤-相关抗原的细胞外和跨膜结构域的基因。作为结 果，B细胞的ccGalCer呈递不受用AdHM的转导的影响(见图21)。免疫 作用后一周，在用B细胞和B/aGalCer免疫的小鼠中，没有观察到靶细胞 的裂解。相反，在用B/AdHM和B/AdHM/aGalCer免疫的小鼠中观察到有 效的细胞毒性T细胞免疫应答(见图22和图24)。
尽管差别不显著，由负载aGalCer的、转导腺病毒的B细胞 (B/AdHMAxGalCer)介导的细胞毒性T淋巴细胞应答比由用腺病毒转导的B 细胞(B/AdHM)介导的那些持续更高且更久。这些结果显示负载在B细 胞上的aGalCer，与肽脉冲不同，不影响细胞毒性T细胞应答的诱导。然 而，当将负载aGalCer的B细胞疫苗施用到小鼠时，刺激了 NKT细胞， 并由此最终体内激活NK细胞，这与施用了用腺病毒转导的B细胞疫苗的 小鼠不同(见图25)。
ii为了测量基于B细胞的疫苗方案在产生细胞毒性T淋巴细胞应答中的 效率，本发明人通过用未达最佳标准的剂量接种小鼠，研究了耙细胞的裂 解，所述未达最佳标准的剂量不足以诱导完全的细胞毒性T淋巴细胞应 答。作为结果，由腺病毒转导从而表达抗原的B细胞能够有效地诱导抗原
特异性细胞毒性T淋巴细胞应答，即使与肽-脉冲的B细胞疫苗相比，其 需要大量的B细胞。由于大约占总数20%的由腺病毒转导的B细胞实际 表达Her-2/"w，所以被迫在作用上低估用腺病毒转导的B细胞的功效。 在移植少量B细胞的情形中，由负载aGalCer的B细胞诱导的NKT细胞 的活化有助于由转导了腺病毒的B细胞诱导的靶细胞裂解。
感染B细胞从而表达肿瘤抗原的病毒能够由腺病毒、反转录病毒、痘 苗病毒、痘病毒和新培斯病毒所示范，但并不总限于此。除使用病毒载体 之外，下列方法能够用于转移编码抗原的基因；l)使DNA与脂质体结合， 从而保护该DNA免于被酶分解或被吸收到内体中；2)使DNA与分子缀 合物或合成的配体结合，从而增加转染功效(例如(ex):脱唾液酸糖蛋 白、运铁蛋白和聚合的IgA); 3)利用PTD (蛋白转导结构域)构建新型 DNA转导系统，从而增加编码抗原的基因的转导效率(例如(ex):Mph-l); 和4)将肽或蛋白质引入到B细胞中，从而呈递抗原。
本发明进一步提供由负载aGalCer的B细胞介导的天然杀伤T细胞活 化剂。
如上文所解释地，本发明的负载aGalCer的B细胞，与负载aGalCer 的树突细胞一样，在体外刺激天然杀伤T细胞杂交瘤，由此诱导IL-2的 分泌(见图30)，并有效地活化/NKT细胞，所述/NKT细胞能够在体内 诱导不同免疫细胞的活化(见图2)。因此，本发明的负载aGalCer的B 细胞能够用作天然杀伤T细胞的活化剂，这正如负载cxGalCer的树突细胞 也能够一样。
本发明还提供了由表达肿瘤抗原的B细胞介导的细胞毒性应答诱导剂。
与用肽脉冲以诱导细胞-介导的免疫应答的B细胞疫苗不同，转导了 腺病毒的B细胞疫苗能够同时诱导细胞-介导的免疫应答和体液免疫应答。 为了证实用AdHM转导的B细胞是否能够诱导Her-2/"ew特异性抗体，分别用B/AdHM和B/AdHM/aGalCer免疫小鼠，并然后测量了血清中的抗 -Her-2/wew抗体滴度。作为结果，在用B/AdHM和B/AdHM/aGalCer免疫 的两个组中，抗-Her-2/"w抗体滴度长期维持在高水平(见图27)。与用 单独的B细胞(B)禾n B/aGalCer免疫的组不同，在用B/AdHM和 B/AdHM/aGalCer免疫的两个组中均产生了体液免疫应答(见图28)。
在用基于B细胞的疫苗免疫后一周时，本发明人进行了表达Her-2/ww 的鼠科肿瘤细胞(TAUF)的静脉内注射，随后研究了存活率。作为结果， 施用了负载aGalCer的B细胞(B/aGalCer)或转导了 AdHM的B细胞 (B/AdHM)的小鼠比施用了单独的B细胞的那些存活得更久。此外，施用 了这样的B细胞的小鼠的抗肿瘤作用比用B/AdHM免疫的小鼠的那些更 显著，所述这样的B细胞用表达Her-2/加"的腺病毒转导，并负载了 aGalCer (见图29)。因此，证实了负载(xGalCer的和转导了腺病毒的B细胞疫苗 能够有效地诱导免疫应答，从而预防肿瘤。
为了证实所述B细胞疫苗的治疗作用，在向小鼠尾静脉静脉内注射 TAUF而建立肺癌之后，分别用B、B/aGalCer、B/AdHM和B/AdHM/aGalCer 免疫BALB/c小鼠。作为结果，在用单独的B细胞处理的小鼠组中观察到 最短的存活时间，且用BAxGalCer疫苗处理的组的结果类似得短。同时， 与用B或B/aGalCer处理的组相比，在用B/AdHM疫苗处理的小鼠组中存 活时间或多或少地得到了延长，但是肿瘤的形成没有得到完全抑制。然而， 与所有其他组相比，用B/AdHM/aGalCer处理的组中的存活时间长得多， 且因此B/AdHM/aGalCer组的抗肿瘤作用优于任何其他免疫的组(见图 29)。
除天然杀伤T细胞配体和B细胞外，本发明的疫苗能够另外包括一种 或多种具有与它们相同或相似作用的有效成分。除以上提及的有效成分 外，所述疫苗还能够包括一种或多种用于施药的药用载体。能够通过混合 多于一种成分来选择或制备所述药用载体，所述成分是选自由下列各项组 成的组中的一项盐水、灭菌水、林格溶液、缓冲盐、葡萄糖溶液、麦芽 糖葡萄糖溶液、甘油和乙醇。可以添加其他的普通添加剂，诸如抗氧化剂、 缓冲溶液、制菌剂等。为了制备可注射的溶液，诸如水性溶液、混悬液和 乳状液，可以另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂。可以以对于每种疾病合适的形式或根据成分，通过遵循雷明顿制药科学
(Remington's Pharmaceutical Science)(最新的版本)，马克出版公司 (Mack Publishing Company), EastonPA中所述的方法进一步制备本发明 的疫苗。
本发明的疫苗能够通过肠胃外施用，并且所述肠胃外施用包括皮下注 射、静脉内注射、肌内注射和胸内注射。为了将疫苗制备为用于肠胃外施 药的制剂，将负载了天然杀伤T细胞配体的B细胞、负载了天然杀伤T 细胞配体和肽的B细胞、或用表达肿瘤抗原的病毒转导的B细胞与稳定剂 或缓冲剂混合，从而生成溶液或混悬液，然后将其配制成安瓿或小瓶(参 见关于生产用于树突细胞转导的病毒载体的标准)。
所述疫苗能够以有效剂量施用，以在患者中诱导免疫应答。例如，能 够一天一次或几次地，以剂量lxl()S lxl(^个细胞/kg，和更优选地，lxl04 个细胞/kg lxl()8个细胞/kg，向患者施用该疫苗。为了制备负载了 ctGalCer 的B细胞疫苗，必须以每lxl(^ lx107个B细胞/ml中1~2 pg/ml的浓度， 向培养基中补充aGalCer。为了制备aGalCer和肽共脉冲的B细胞疫苗， 培养基必须以每lx106 lx107 B细胞/ml中1~2吗/ml的浓度补充aGalCer 和以每lx106 lxl07B细胞/ml中1~10 Kg/ml的浓度补充肽。
aGalCer似乎在啮齿动物和猿中不诱导毒性(Nakata等，癌症研究 (Cancer Res.) , 58: 1202-1207, 1998)。当将2200昭/kg的aGalCer施用于 小鼠时，尚没有报告副作用(Giaccone等，临床癌症研究(Clin. Cancer Res.)， 8:3702,2002)。由临床试验，按照aGalCer的全身施用，己经报告了轻微 的头痛作为副作用(Mie Nieda等，血液(Blood) ， 103: 383-389， 2004， Giaccone等，临床癌症研究(Clin. Cancer Res.) ，8:3702,2002)，这能够通 过施用对乙酰氨基酚得到预防。如果可能，存在很少的机会来显示轻微的 全身性副作用(Giaccone等，临床癌症研究(Clin. Cancer Res.) ， 8: 3702， 2002)。在本发明中，通过剂量增加研究，aGalCer不引起剂量-限制性毒性 (50-4800 jig/m2)，并且显示出耐受性，这说明aGalCer是非常安全的物质。
本文中的肽包括病毒、细菌、真菌、寄生虫和肿瘤来源的抗原肽，并 且通过病毒载体介导向B细胞中引入的抗原包括病毒、细菌、真菌、寄生 虫和肿瘤-来源的抗原。"抗原"意指在侵入宿主时，通过被免疫系统识别而能够诱导免疫应 答的任一物质(例如(ex)，蛋白质、肽、肿瘤细胞、糖蛋白、糖脂、活 病毒、杀死的病毒、DNA等)。所述抗原可以以纯化的或非-纯化的形式制
备，但是纯化的形式是优选的。本发明的抗原包括病原体蛋白、重组蛋白、
肽、多糖、糖蛋白、脂多糖和DNA分子(多核苷酸)、肿瘤细胞、活病毒 和杀死的病毒。
可以将下面的抗原列表中存在的抗原提供为用于诱导免疫应答的工 具，而替代本发明实施例的肿瘤-相关抗原，但是不总限于此。所述列表包 括流感病毒抗原(血凝素和神经氨酸酶抗原)、百日咳博德特氏菌
(Bordetellapertussis)抗原(百日咳毒素、丝状血凝素和pertactin)、人乳 头状瘤病毒(HPV)抗原(糖蛋白)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)抗 原(血清组A, B, C， Y和W-135的荚膜多糖)、破伤风类毒素、白喉抗原
(白喉类毒素)、肺炎球菌抗原(3型肺炎链球菌(Streptococcuspnemoniae) 荚膜多糖)、结核抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原(GP-120、 GP-160、 p18、 Tat、 Gag、 Pol和Env)、霍乱抗原(霍乱毒素B亚基)、葡萄球菌抗 原(葡萄球菌肠毒素B)、志贺氏菌属(shigella)抗原(志贺氏菌属多糖)、 疱疹性口炎病毒抗原(疱疹性口炎病毒糖蛋白)、巨细胞病毒(CMV)抗原、 肝炎抗原(甲型肝炎(HAV),乙型肝炎(HBV),丙型肝炎(HCV)， 丁型肝炎 (HDV)和庚型肝炎(HGV)抗原)(核心抗原和表面抗原)、呼吸道合胞病毒 (RSV)抗原、单纯疱疹抗原或它们的组合物(例如(ex),白喉、百日咳和 破伤风、DPT)、疏螺旋体属物种(Borrelia sp.)抗原(例如(ex)， OspA, OspB 和OspC抗原)、白色念珠菌(Candida albicans)抗原(例如(ex) ， MP65) 和疟原虫抗原(例如(ex) ，CS蛋白)。
肿瘤抗原是通过野生型基因的体突变产生的。癌症抗原包括归因于肿 瘤细胞遗传不稳定性的肿瘤-特异性抗原，和肿瘤-相关抗原，内源自体抗 原，其较多地在肿瘤细胞中表达，并临时地在肿瘤发育阶段表达或限制性 地表达于特异性组织中。肿瘤特异性抗原例如HPVE6/E7，其为癌症病毒 来源的抗原，且肿瘤-相关抗原例如gp100、酪氨酸酶，TRP-1 (酪氨酸酶-相关蛋白-l)、 TRP-2 (酪氨酸酶-相关蛋白-2)、 MAGE、 MUC-1、 CEA (癌 胚抗原)、p53、a-甲胎蛋白和Her-2/"ew等(Rosenberg SA.，自然(Nature)，17;411(6835):380-4, 2001)。
附图简述
参考附图，更好地理解本发明的优选实施方案的应用，在附图中
图1-图3是举例说明zmT细胞和负载aGalCer的B细胞之间相互活 化作用的图。
图1是一组图，其举例说明在消耗CDllc+细胞后，从脾纯化B细胞， 并随后通过流式细胞计数法测量CD19、 CDllc和CDld的表达。
图2是一组屈，其举例说明用单独的赋形剂，用自由形式的otGalCer， 或用负载aGalCer的B细胞(B/aGalCer)或DC (DC/aGalCer)静脉内注射 C57BL/6野生型或J281一小鼠，然后获得来自受体小鼠的脾细胞，并通过 ELISPOT测定分析生产IL-4-和IFN-y的细胞。
图3是一组图，其举例说明用CFSE染色负载赋形剂的或负载ocGalCer 的B细胞，并将其注射到C57BL/6小鼠中。分析了来自脾细胞的CFSE+ 细胞。
图4-图6是显示用aGalCer和肽(0￥八257.264)共脉冲的B细胞活化肽特 异性CD8+T细胞的图。
图4是一组图，其举例说明将CFSE标记的OVA257.264特异性CD8+ T 细胞(OT-I T细胞)移植到C57BL/6小鼠中，所述小鼠已经分别施用了 B/赋形剂、B/aGalCer、 B/pep或B/aGalCer/p印。然后，通过流式细胞计数 法研究OT-l T细胞增殖和细胞因子分泌。
图5是一组图，其举例说明用指定形式的B细胞(单独的B、BAxGalCer, B/pep或B/ctGalCer/pep)接种C57BL/6小鼠。 一、三或五周后，通过注射 CFSE-标记的同源靶标进行体内CTL测定。
CFSES:肽-脉冲的靶标，
CFSEffi:肽-未脉冲的对照
图6是一组图，其举例说明在施用基于B细胞的疫苗后7天时(左图)
或在另外用负载OVA257.264的同源脾细胞进行另外的CTL致敏后7天时(右
图)，计算生产IFN-y的CD8+ T细胞对OVA257_264体外再刺激的应答。
图7和图8是比较基于B细胞和基于DC的细胞疫苗之间细胞毒性T
16淋巴细胞生成效率的图。
图7是一组图，其举例说明连续稀释OVA257.264肽脉冲的
B/aGalCer/pep禾B DC/aGalCer/pep，然后将它们施用于小鼠中，并且然后
测量针对的OVA^.264体内细胞毒性。
图8是一组图，其举例说明通过与图7中所述相同的方式施用 OVA257-264脉冲的B/赋形剂/p印和DC/赋形剂/pep，并然后测量针对的
OVA257.264体内细胞毒性。
图9和图10是显示参与由基于B细胞的疫苗诱导的CTL应答的免疫 细胞类型的图。
图9是一组图，其举例说明将用aGalCer和0￥八257.264共脉冲的B细 胞注射到小鼠中。受体小鼠接受消耗免疫细胞的mAb，然后检测针对
OVA257.264的体内细胞毒性。
图10是一组图，其举例说明将用aGalCer和OVA257.264肽共脉冲的B 细胞注射到野生型、Ja281一或MHCirZ'类小鼠中，并随后进行标准的51Cr 释放测定，从而研究针对OVA257.264的体外细胞毒性。
图11和图12是显示用aGalCer和OVA257-264肽共脉冲的B细胞对 CD8+ T细胞起到直接的抗原呈递细胞作用的图。
图ll是一组图，其举例说明在被注射到野生型小鼠中前，用aGalCer 和OVA257.264共脉冲来自野生型小鼠或bm-l小鼠的B细胞，然后测量针 对的OVA257.264的体内细胞毒性。
图12是一组图，其举例说明用aGalCer和OVA257.264共脉冲的B细胞 或用'OVA257.264脉冲的B细胞和用aGalCer脉冲的B细胞的组合物，接 种C57BL/6小鼠，然后测量针对的OVA257_264的体内细胞毒性。
图13-图16是举例说明基于B细胞的疫苗能够提供针对OVA-转染的 B16黑素瘤的预防性和治疗性抗肿瘤免疫性的图。
图13是举例说明用指定的细胞疫苗(单独的B、 B/aGalCer、 B/pep、 B/aGalCer/pep、 DC/pep或DC/aGalCer/pep)接种C57BL/6小鼠的图。7 天后，将MO-5肿瘤细胞皮下注射到小鼠中，并然后测量肿瘤的质量。图14是举例说明在图13中所示的无肿瘤小鼠中受到再刺激的肿瘤细
胞生长得到抑制的图。第一次肿瘤接种后7天时，用MO-5细胞(2xl()S)皮
下再刺激无肿瘤小鼠，并测量肿瘤的质量。
图15和图16是举例说明用指定的细胞疫苗(单独的B、 B/aGalCer, B/pep, B/aGalCer/pep, DC/pep或DC/aGalCer/pep)接种C57BL/6小鼠的图。 l天或9天后，将MO-5肿瘤细胞皮下注射到小鼠中，并然后测量肿瘤的 质量，
*，与"单独的B"对照组(图13，图15和图16)或与年龄-匹配的 首次实验小鼠(图14)的比较，p<0.05。
图17-图19是举例说明基于B细胞的疫苗引发针对表达Her-2/ eM的 肿瘤的治疗性抗肿瘤免疫性的图。
图17是一组图，其举例说明在如所示与aGalCer或赋形剂加上 Her-2/^M63."(hP63)共培养后，用B细胞或DC接种BALB/c小鼠，并然后 进行体内CTL测定。
图18和图19是这样的图，其举例说明通过与上述相同的方式，用 CT26-Her2/"w静脉内(图18)或皮下(图19)剌激BALB/c小鼠，随后 用B细胞或DC免疫所述小鼠，并测量这些小鼠的存活率(图18)或肿瘤 生长(图19)。
图20和图21是这样的图，其举例说明检测利用病毒载体转导具有完 整抗原的B细胞的方法是否能够应用到B细胞疫苗中的试验。
图20是一组图，其举例说明用这样的腺病毒(AdHM)感染B细胞， 并然后测量B细胞表面上的Her-2/"ew表达，所述腺病毒表达Her-2/"ew， 即肿瘤-相关抗原的细胞外结构域和跨膜结构域。
图21是这样的图，其举例说明转导AdHM的和负载aGalCer的B细胞 能够活化DN32.D3细胞。具体地，分别与单独的B细胞、 负载aGalCer的B细胞、转导AdHM的B细胞，和转导AdHM的并 负载aGalCer的B细胞一起培养DN32.D3细胞，并然后通过ELISA测量 每份上清液中的IL-2水平。
图22-图24是举例说明用肿瘤-相关抗原Her-2/"w转导的B细胞有效 诱导细胞毒性免疫应答的图。图22是这样的图，其举例说明分别用从BALB/c小鼠脾细胞中分离并 然后用腺病毒转导的B细胞(B/AdHM)、另外负载了 aGalCer的B细胞 (B/AdHMAxGalCer)、单独的B细胞和负载了 aGalCer的B细胞(B/aGalCer) 免疫小鼠。向每只小鼠移植了负载有细胞毒性T细胞表位的靶细胞，从而 研究体内抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞应答。
图23是比较每个用B/AdHM和B/AdHM/aGalCer免疫的小鼠组中的 细胞毒性T细胞应答持续时间的图，
图24是这样的图，其比较了在用细胞毒性T细胞肽体外刺激每只小 鼠之前和之后，由CD8+T细胞分泌的IFN-y水平，所述小鼠是用 B/AdHM和B/AdHM/aGalCer免疫的，
首次用于实验的没用疫苗处理过的小鼠组
图25和图26是这样的图，其举例说明转导了腺病毒的B细胞疫苗 (B/AdHMAxGalCer)能够有效地活化天然杀伤细胞并诱导细胞毒性T细胞应答。
图25是显示天然杀伤细胞活化的图。
图26是显示依赖于细胞疫苗剂量的靶细胞裂解的图，对其进行研究， 从而比较诱导细胞毒性T细胞的效率。
图27和图28是举例说明用转导了 AdHM的B细胞疫苗 (B/AdHM和B/AdHM/aGalCer)能够诱导Her-2/"w特异性抗体的图，
图27是这样的图，其举例说明分别用B/AdHM和B/AdHM/aGalCer 免疫BALB/c小鼠，并然后测量抗-Her-2/"w抗体的滴度，从而研究血清 中抗-Her-2/"w抗体与在其表面上表达Her-2/"e"的鼠科肿瘤细胞(TAUF) 的结合。
图28是显示各组的体液免疫应答的图。
图29是一组图，其显示转导了腺病毒的B细胞疫苗的抗肿瘤活性。 具体地，通过用TAUF接种，在小鼠中诱导肺癌，随后用所述B细胞疫苗 进行免疫。
图30是一组图，其举例说明通过由负载aGalCer的B细胞诱导的天 然杀伤T细胞的活化根据aGalCer的浓度分泌IL-2 ，和通过由负载otGalCer的B细胞或DC诱导的天然杀伤T细胞的活化根据细胞浓度 分泌IL-2， IL-2是关于天然杀伤T细胞活化的指标。
图31-图35是这样的图，其举例说明通过施用能够体内消耗CD4+、 CD8+或NK1.1细胞的抗体能够消除特异性免疫细胞。
图36是显示由基于B细胞的疫苗诱导的针对胸腺瘤(EG-7)的抗肿 瘤免疫活性的图。
*，p<0.001 :统计学显著性，与仅用B细胞处理的组相比。
发明方式
本发明的实施的和目前优选的实施方案如下述实施例所示进行举例 说明。
然而，应该理解，考虑到本内容，本领域的那些技术人员可以在本 发明的精神和范围内进行修改和改进。
实施例1:负载aGalCer的B细胞和/NKT细胞的双向活化 <1-1>比较由B细胞诱导的和由DC诱导的/NKT细胞的活化
由于已经充分确定了负载aGalCer的DC活化z'NKT细胞(Kim, S.，等, 合成(Synthesis) ,847,2004)，本发明人研究了负载aGalCer的B细胞是 否具有与负载aGalCer的DC相似的作用。
使用了处于6-10周龄的雌性C57BL/6和BALB/c小鼠。从杰克逊 (Jackson)实验室购买了 OT-I和C57BL/6b"11 (bml)小鼠，而J281—小鼠 和MHC irM、鼠分别是由Chung博士(首尔国立大学(Seoul National University),韩国)(Kim JH等，美国病理学杂志(Am J Pathol.), 167(5):1231-41， 2005)和Park博士 (韩国大学(Korea University),韩国) (Park, S. H.，等，试验医学杂志(J. Exp. Med.) 193:893, 2001)提供的。所有 小鼠在韩国首尔国立大学的制药研究动物中心(Animal Center for Pharmaceutical Research)中保存在无特异性病原体的条件下。从杂交瘤即 GK1.5 (抗-CD4: ATCC编号TIB-207)、 2.43 (抗-CD8; ATCC编号 TIB-210)和PK136 (抗-NKl.l; ATCC编号HB-191)获得抗体，并进行腹膜 内(i.p.)注射(150pg/小鼠)，以在体内消耗各自的淋巴细胞子集。具体地，为了从每只小鼠中分离B细胞，从小鼠中摘除脾，随后进行
匀浆。在通过抗-CDllc微珠(Miltenyibiotec)从脾中消耗CD1 lc+细胞后， 本发明人利用抗-B220微珠(Miltenyibiotec)分离了纯B细胞。这些细胞 中>99%是CD19-阳性的(见图1)。
为了从脾中分离树突细胞，将从小鼠中取得的脾置于7ml培养基中， 该培养基中含有胶原酶D(lmg/ml，罗氏(Roche))和DNasel(50(ig/ml，西 格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich))，随后在37'C反应30分钟。向该培养基中 加入EDTA (最终浓度是10mM，pH7.2)，随后再进一步反应5分钟。通 过15.5% Accudenz密度梯度(精确化学和科学(Accurate Chemical & Scientific))，将树突细胞与脾细胞分离。
将纯化的细胞(B细胞或DC)在C02培养箱中，与aGalCer (l吗/ml)或 赋形剂(0.5%聚山梨酸酯)一起共培养14小时。然后，将该细胞与 天然杀伤T细胞杂交瘤，即DN32.D3 —起共培养(Claire Forestier等，免 疫学杂志(The Journal of Immunology) ，171:4096,2003);然后通过夹心 ELISA测量IL-2，其作为NKT活化的指示剂。
作为结果，负载aGalCer的DC (DC/aGalCer)刺激DN32.D3产生IL-2。 类似地，负载aGalCer的B细胞(B/aGalCer)有效地刺激DN32.D3细胞产 生IL-2，当处于与杂交瘤较高的比例时，等同于DC组的IL-2生成率，但 是当处于较低的比例时，达不到DC组的IL-2生成率(见图30)。
<1-2>活化天然杀伤T细胞依赖性免疫应答
为了研究体内施用的B/aGalCer和DC/aGalCer是否可以活化免疫细 胞，本发明人将来自C57BL/6小鼠的B/aGalCer或DC/aGalCer静脉内注 射到同种小鼠中，并通过ELISPOT测量生产IL-4和IFNy的细胞的水平。 具体地，用赋形剂、(xGalCer、负载aGalCer的B细胞或负载aGalCer的DC 静脉内注射野生型C57BL/6或Ja28W-小鼠。 一周后，分离脾，从而制备 单细胞，将所述单细胞置于ELISPOT平板上。将赋形剂或aGalCer添加 到该平板上，随后培养6小时以进行刺激。按照供应商的说明(IL-4 ELISPOT试剂盒，IFN-y ELISPOT试剂盒；R&D系统(R&D system))进行 ELISPOT,从而测量分泌IL-4和IFN-y的细胞。作为结果，注射B/aGalCer和DC/aGalCer均诱导大量生产 IL-4和IFN-y的细胞(图2)。然而，应该注意，即使在缺乏aGalCer再刺 激的条件下，检测到显著数量的这些生产细胞因子的细胞。不过，本发明 人认为生产IL-4和IFN-Y的细胞的诱导不依赖于z'NKT细胞，因为它不发 生在缺乏zNKT群的J281-A小鼠中(见图2)。
<1-3>由天然杀伤T细胞活化引起的B细胞的活化
为了确定如果注射后在B细胞中诱导了任何变化将会怎么样，本发明 人静脉内施用CFSE (羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯)标记的B/aGalCer，并 然后分析CFSE+细胞上的共刺激分子。具体地，从C57BL/6小鼠的脾和淋 巴结获得淋巴细胞，并且利用抗-CDllc微珠(Miltenyibiotec)消除CDllc十 细胞。利用抗-B220微珠(Miltenyibiotec)分离B细胞。用10 一 CFSE 标记分离的B细胞，将其注射到同种小鼠的尾静脉中。为了用CFSE标记， 以适当的浓度，在RPMI培养基中稀释CFSE (分子探针(Molecular Probe))，随后在37。C反应15分钟进行标记。用RPMI培养基清洗该细 胞三次，以消除残留的CFSE。标记后24和48小时，通过流式细胞计数 法研究了从该小鼠的脾和淋巴结分离的CFSE+细胞中的共刺激分子。
作为结果，在24小时内诱导了高水平的CD86而非CD80的表达。 CD40和MHCII也受到轻微的上调(图3)。即使注射后48小时，仍没有 观察到CD80的上调，并且所有其他结果很大程度上保持与24小时的水 平一致。换句话说，在24小时内，由B/aGalCer活化的天然杀伤T细胞 激活了B细胞。
考虑实施例<1-1> 、 <1-2>和<1-3〉的结果，证实了 DC/aGalCer和B/aGalCer均能够在体外和体内地完全活化/NKT细胞，且 该活化作用在体内是双向的(因为zNKT和B细胞均被活化了)。
实施例2:肽-脉冲的B/aGalCer促进肽-特异性CD8+ T细胞的活化
本发明人检查了 aGalCer和MHC I-限制的肽在B细胞上的共脉冲是 否能够使肽-特异性CD8+T细胞致敏。为了该目的，本发明人首先适当地 将CFSE-标记的OVA-特异性CD8+T细胞(OT-I)移植到C57BL/6小鼠中，然后施用赋形剂-脉冲的B细胞(单独的B) ， B/(xGalCer，赋形剂 和OVA257-264肽-脉冲的B细胞(B/pep)，或ctGalCer和OVA257-264 肽-脉冲的B细胞(B/aGalCer/pep)。 48小时后，从脾获得单细胞，并然后 观察到OT-I细胞的增殖。同时，将分泌IL-2和IFN-y的OT-I细胞与1 fiM 0￥八257.264肽和1 ^L/mL GolgiPlug —起培养4小时，并且然后利用 Cytoperm/Cytofix试剂盒(BD Pharmingen)进行细胞内细胞因子染色。
作为结果，在接受单独的B的小鼠中几乎不诱导OVA-特异性CD8+T 细胞(OT-I细胞)的分裂；然而，在B/aGalCer组中，注意到OVA-特异 性CD8T细胞的弱分裂，其以Ag-非特异性方式进行(图7, 1.2±0,5%相 对5.4 ±1.8%)。注射B/pep诱导了OT-I大量分裂，但是体外再刺激后， 非常少量的这些细胞产生IL-2(<4%)，且相对少量的细胞产生IFN-y (38%)。 相反，被给予了B/aGalCer/pep的小鼠显示出增强的OT-I分裂，其中多于 40%的由此生成的细胞产生IL-2，并最令人惊讶地，多于90%产生比B/pep 组高得多的水平的IFN-y (图4)。
这些结果提示高得多的CD8+ T细胞活化率能够通过将otGalCer负载 于B/pep上而获得。
实施例3:由BAxGalCer/pep引起的长期持久的细胞毒性T细胞应答和免 疫耐受性的克服
<3-1>由B/aGalCer/pep诱导的长期持久的细胞毒性T细胞应答
本发明人研究了基于B细胞的疫苗方法是否能够诱导细胞毒性免疫 性。为了该目的，本发明人向C57BL/6小鼠组静脉内注射了单独的B、 B/ctGalCer、 B/pep或B/aGalCer/pep，并且然后确定体内CTL活性。另夕卜， 本发明人研究了由基于B细胞的疫苗诱导的细胞毒性免疫应答是否能够 持续。具体地，分别用单独的B、 B/aGalCer、 B/pep和B/aGalCer/pep免 疫C57BL/6小鼠。在免疫作用的第一、第三和第五周，进行了体内CTL 测定。同源淋巴细胞在被用20 (CFSE ,或2 (CFSECFSE进行
标记前，负载了 OVA257-264肽或保持不接触的。将相等数量的这两种群体
混合，并将其静脉内注射到小鼠中。第二天，获得单细胞，并且通过流式
23细胞计数法测量CFSE胃和CFSE气较小数量的CFSE "意味着较高的细胞 毒性免疫应答。
作为结果，只有B/aGalCer/pep完全裂解肽-脉冲的靶标，并且其甚至 在单次注射后5周还维持全部的细胞毒性。同时，小鼠中B/pep和 B/aGalCer均不诱导任何肽-特异性CTL应答。只有B/aGalCer/pep-处理的 组在针对OVA257.264的生产IFN-y的CD8+ T细胞的数量上，显示出显著的 增加(图6，左图)。
<3-2>证实由B/aGalCer/pep引起的免疫耐受性的克服
通常，单独施用抗原诱导免疫耐受性。因此，本发明人研究了当在B 细胞上负载aGalCer和肽时，抗原诱导的免疫耐受性是否能够得到克服。 具体地，通过与实施例<3-1>所述的相同的方式免疫C57BL/6小鼠。1周 后，获得脾细胞，随后用OVA-包被的同源脾细胞刺激1周。通过细胞内 细胞因子染色，测量在受刺激的脾细胞中的分泌IFN-丫的CD8+T细胞。
作为结果，被给予单独的B或B/aGalCer的小鼠针对致敏正常应答， 并产生大量的肽-特异性生产IFN-y的CD8+T细胞(图6，右图)。然而， 被给予B/pep的小鼠在生产IFN-y的CD8+T细胞数量上没有显示出增多， 这提示这些小鼠耐受所述肽。
相反，用B/cxGalCer/pep接种的小鼠获得了比被给予单独的B或 BAxGalCer的组所获得的多得多的肽-反应性CD8+T细胞数量。同时，没 有将任何抗原施用于用单独的B或BAxGalCer接种的小鼠，因此，在所述 小鼠中没有诱导抗原特异性免疫应答，并且用OVA-包被的脾细胞的体外 刺激是引起免疫应答的首次且唯一的刺激。然而，用B/aGalCer/pep接种 的小鼠已经施用了抗原，因此用OVA-包被的脾细胞进行体外刺激是记忆 性应答。总之，B/aGalCer/pep克服免疫耐受性，这显示出免疫原性和强记 忆性应答。
实施例4:基于B细胞的疫苗是与基于DC的疫苗一样有效的CTL产生剂 本发明人比较了基于B细胞的疫苗与DC-疫苗在产生细胞毒性上的功效。为了该目的，本发明人确定了在体内获得完全的靶标裂解所需要的最
小细胞数量。具体地，将B细胞或DC用aGalCer或赋形剂一起共培养16-18 小时，并且然后用1 ng/ml OVA257.264脉冲1小时。将连续稀释的细胞静脉 内注射到同种小鼠中，并进行体内CTL测定。如在上述实施例中所解释 的那样，将肽-脉冲的靶标标记为CFSE气并将没有用肽脉冲的对照细胞 标记为CFSE ffi。将相等数量的这两种群体混合，并将其静脉内注射到小 鼠中。不久后，通过流式细胞计数法检查小鼠脾细胞，以计算CFSE CFSE 8的比例，从而测量抗原特异性靶细胞裂解。
作为结果，用DC/aGalCer/pep注射的小鼠显示出与16,000个细胞一 样少的完全靶细胞裂解。引起兴趣的是，用80,000个B/aGalCer/pep细胞 的单次接种足以引起完全的肽-特异性细胞裂解，而用16,000个细胞的接 种产生中度细胞毒性(图7)。然而，假设DC的表面积比B细胞的表面 积大得多，则能够认为在产生细胞毒性上，BAxGalCer/pep与 DC/aGalCer/pep—样有效。DC/pep有效地产生了 OVA-特异性细胞毒性， 而B/pep-处理，无论所检査的细胞的数量，不产生该毒性(图8)。值得 注意地，DC/pep-处理的组的体内细胞毒性模式非常类似于 DC/aGalCer/pep-处理的组的，这说明了向DC上负载aGalCer不增强 DC/pep的免疫功效。
实施例5:由B/aGalCer/pep产生CTL的要求
本发明人检查了哪种类型的免疫细胞参与了 CTL应答的产生。为了该 目的，本发明人用消耗的Ab(抗-CD4消耗Ab: GK1.5，抗-CD8消耗抗体 2.43,抗-NKl.l消耗抗体PK136)注射小鼠。4天前或4天后，用 BAxGalCer/pep对它们进行接种，并然后进行体内CTL测定。
作为结果，消耗的时间没有影响，因为CTL活性的产生不受以下任一 种情形的妨碍CD4+或NKl.l+细胞的消耗(图9)。相反，CD8的消耗 完全阻断靶细胞的杀死。与这些结果相一致，MHCI广小鼠(缺乏CD4+T 细胞)发育正常的CTL应答，而Ja281一小鼠(缺乏WKT细胞)未能做 到这些(图10)。实施例6:由B细胞引起的抗原-呈递和细胞毒性T淋巴细胞的诱导
可以争论地，肽-脉冲的B细胞不起APC而起肽储存器的功能，宿主
DC从所述储存器中取得肽，从而诱导CTL应答。为了研究这种可能性， 本发明人使用bm-l小鼠(Norbury， C. C.等，科学(Science) 304, 1318-1321, 2004)。这些小鼠的细胞能够将OVA肽负载到它们的MHC I上，但是， 由于H-2K区域中的突变，由此产生的复合物不被同族CD8+T细胞识别。 来自该品系的B细胞正常表达CDld，并应答aGalCer而刺激/NKT活化， 这说明B和/NKT之间的相互作用是完整无损的。
此外，当利用来自野生型小鼠的B细胞制备B/aGalCer/pep，并然后 将其注射到野生型小鼠中时，产生了完全的体内OVA-特异性细胞毒性。 然而，当将源自bm-l小鼠B细胞的B/aGalCer/pep注射到野生型小鼠中 时，未能产生OVA-特异性细胞裂解活性，这提示受体小鼠中的DC或其 他专门的的APC不是造成CTL产生的原因(图ll)。
本发明人研究了当aGalCer和肽分别脉冲并然后一起注射时，是否可 能产生CTL。为了该目的，用'B/aGalCer加B/pep，或单独的B/aGalCer/pep 静脉内注射C57BL/6小鼠，并进行体内CTL测定。
作为结果，用'B/aGalCer加B/pep，接种的小鼠未能产生体内细胞毒性 (图12)。该结果证明为了产生细胞毒性，肽和aGalCer必须在相同的B 细胞上呈递。
实施例7: B/aGalCer/pep的抗肿瘤作用 <7-1>利用OVA模型的体内检验
本发明人检査了接种B/aGalCer/pep是否能够产生抗肿瘤免疫性。为 了检验预防性抗肿瘤活性，在将OVA-转染的B16黑素瘤(MO-5) (Kenneth Rock博士，马萨诸塞大学(University of Massachusetts) : Falo, L. D.,等，自 然医学(Nat. Med.) 1: 649， 1995)皮下移植到小鼠组中之前，用单独的B、 B/aGalCer、 B/pep、 B/aGalCer/pep、 DC/pep或DC/aGalCer/pep对它们接 种一次。作为结果，在用B/aGalCer接种的小鼠中观察到了稍微延迟的肿 瘤生长模式，尽管所有的小鼠最后都发展了肿瘤(见图13)。相反，接受 了 B/aGalCer/pep、 DC/pep或DC/aGalCer/pep的小鼠没有发展肿瘤。
26为了检査这些小鼠是否引起长期持久的抗肿瘤活性，本发明人在第一 次肿瘤接种后70天时，用M0-5肿瘤再次剌激了存活的瘤小鼠。作为结
果，本发明人在那些小鼠中没观察到肿瘤生长(见图14)，这证明用 B/aGalCer/pep接种引起了针对所述肿瘤的记忆免疫性。当本发明人利用不 同来源的肿瘤，即转染OVA的胸腺瘤(EG=7)，进行类似的试验时，获得 的非常相似并一致的结果(图36)。
本发明人研究了接种B/aGalCer/pep是否能够根除预先存在的肿瘤。 为了该目的，本发明人构建了两种治疗模型当肿瘤变得可触摸到时，皮 下移植后(i) l天或(ii) 9天，对小鼠进行接种。
在所述1天的模型中，接种DC/pep或DC/aGalCer/pep几乎完全地抑 制了肿瘤生长。有趣地是，在接种了 B/aGalCer/pep的小鼠中，也完全减 少了肿瘤的生长(图5)。在所述9天的模型中，由于B16黑素瘤非常具 有侵略性的性质，这些接种中无一完全地破坏生长中的肿瘤。然而，在接 种了 B/aGalCer/pep的小鼠中，肿瘤的生长不如"单独的B"小鼠组中的 明显，并且类似于DC/pep-或DC/aGalCer/pep-接种的组中观察到的(图 16)。
<7-2>利用Her-2/朋w模型的体内检验
为了研究基于B细胞的疫苗是否能够应用于真正的肿瘤Ag中，通过 与上述实施例<7-1>中所述的相同方式，利用TAUF(PenichetML等，实验 室动物科学(Lab AnimSci.) ,49: 179-88, 1999)，即表达Her-2/"e"的肿瘤 细胞系，进行试验。该肿瘤Ag得到了充分的表征，并且其CTL表位是已 知的。此外，本发明人在被给予 了 负载aGalCer的Her-2/"e^,脉冲的B细胞的小鼠中，观察到显著水平的 Her-2/"ew-特异性体内细胞毒性(图17)。
为了检查该模型中的抗肿瘤活性，本发明人在用Her-2/^z^,脉冲的 负载aGalCer的B细胞接种BALB/c小鼠前，向它们静脉内或皮下注射表 达Her-2/"ew的肿瘤细胞(TAUF )。静脉内肿瘤接种后，用 B/aGalCer或B/pep接种的那些小鼠的存活率比用单独的B接种的那些略 好(图18)。相反，用B/aGalCer/pep接种的所有小鼠在该试验中始终存活。这些存活的小鼠还耐受TAUF的再刺激。在皮下肿瘤生长模型中，观 察到类似的结果(图19)。
总而言之，证明了基于B细胞的疫苗方案，在产生预防性和治疗性抗 肿瘤免疫性上，与基于DC的疫苗一样有效。
实施例8:利用表达抗原的病毒载体引入完整的抗原
肽-脉冲的细胞疫苗通常是不能使用的，因为肽的应用受限于主要组织
相容性复合体(MHC)的单元型，并仅能够呈递单一表位。另一方面，病 毒介导的完整抗原能够在不受MHC单元型的限制下被广泛使用，并能够 诱导体液免疫应答和细胞介导的免疫应答，这说明其能够诱导不同的表位 特异性免疫应答。基于此，本发明人研究了通过病毒载体用完整抗原转导 的B细胞是否能够有效地诱导免疫应答。首先，本发明人制备了递送基因 的腺病毒(AdHM)，并将其注射到小鼠模型中，所述基因编码肿瘤-相关 抗原Her-2/"ew (HM)的细胞外结构域和跨膜结构域。
具体地，从BALB/c小鼠的脾细胞中分离B细胞，并且与100 MOI 的引入HM的腺病毒(AdHM, Viromed)—起在无血清条件下，37。C培养 90分钟，用于进行转导。然后，向其中增补血清，随后分别进一步培养8 小时，24小时和48小时。用PE标记的抗-Her-2/nw抗体(BD生物科学(BD biosciences) #340552)染色细胞，从而进行流式细胞计数。测量在细胞表 面上表达的Her-2/ww的水平(研究了关于B细胞的腺病毒转导效率和总 B细胞中PE+细胞的百分比)。
B细胞与腺病毒一起培养8小时、24小时和48小时后，证实了转导 效率在每种培养条件下大于20% (图20)。具体地，当B细胞与AdHM 一起共培养大于8小时后，B细胞完全转导了 AdHM，并且因此，Her-2/"eM 在B细胞表面上表达。Her-2/wew在B细胞表面上的表达不受与aGalCer 一起培养的影响。另外，B细胞呈递aGalCer的能力也不受影响(图21)。 如上文中所解释地，以上结果表示当通过B细胞上的CDld分子向 DN32.D3细胞呈递aGalCer时，活化的DN32.D3细胞分泌IL-2。因此， 测量在培养物上清液中的IL-2的水平能够证实B细胞是否能够呈递aGalCer，并且，在本发明中，证实了培养物上清液中的IL-2分泌，这支 持B细胞能够呈递aGalCer。
实施例9:由转导腺病毒的B细胞诱导的细胞毒性T细胞应答
从BALB/c小鼠的脾细胞中分离B细胞，在37。C培养箱中，无血清条 件下，用100 M.O.I腺病毒转导所述B细胞60分钟，所述腺病毒表达 Her-2/"w细胞外结构域和跨膜结构域。然后，向其中增补血清，随后进一 步培养24小时，以制备B/AdHM细胞。将转导了 AdHM的B细胞在增补 了 1~2 pg/ml aGalCer的含有血清的培养基中培养23小时，这导致了 负载aGalCer的B细胞(B/AdHM/aGalCer)。用RPMI清洗制备的B细胞 多于3次，从而消除残留的腺病毒和(xGalCer。
本发明人向小鼠静脉内施用所述B细胞疫苗，以研究用所述AdHM 转导的B细胞是否能够诱导细胞毒性免疫应答。将施用了单独的B细胞 (B)和负载aGalCer的B细胞(B/aGalCer)的小鼠用作阴性对照。测量了 由转导了 AdHM的B细胞(B/AdHM)以及aGalCer禾Q AdHM共 脉冲的B细胞(B/AdHM/aGalCer)诱导的Her-2/股w特异性细胞毒性T细 胞应答。免疫作用后，注射负载了细胞毒性T细胞表位肽(Her-2/^^.", Anygene)的耙细胞，随后研究体内CTL活性。
作为结果，免疫作用后1周后，在用单独的B和B/aGalCer免疫的组 中没有观察到靶细胞的裂解，而在用B/AdHM和B/AdHM/aGalCer免疫的 小鼠组中观察到细胞毒性T细胞应答(图22)。转导了腺病毒的B细胞 活化能够在无需天然杀伤T细胞的帮助下，有效地诱导体内细胞毒性T细 胞应答，这说明能够将它们用作抗原呈递细胞。由 B/AdHM和B/AdHM/aGalCer诱导的细胞毒性T细胞应答逐渐减少，但是 从免疫作用开始直到7周时，应答持续在显著水平(图23)。免疫作用后 l周，测量了 CD8+ T细胞中的IFN-y分泌，以及细胞毒性T细胞应答。 作为结果，与仅用B细胞处理的组中的相比，用 B/AdHM和B/AdHM/aGalCer处理的小鼠组中活化的CD8+T细胞的数量 增多了，且更特殊地，用B/AdHM/aGalCer处理的组中的CD8+T细胞的 数量比用B/AdHM处理的组中的略高(图24)。实施例10:由负载aGalCer的B细胞引起的天然杀伤细胞的活化和转导了 腺病毒的B细胞疫苗的疫苗作用的改进 <10-1>由负载aGalCer的B细胞活化天然杀伤细胞
基于那些分泌的IFN-Y，计算活化的天然杀伤细胞。具体而言，从小 鼠脾细胞中分离B细胞，并然后在含有1 ng/ml GolgiPlug的培养基中培养 5小时。用IFN-y:APC、 CD3:PE和CD49b:FITC抗体(全部Biolegend) 对该细胞进行染色。天然杀伤细胞由表达CD49b，即天然杀伤细胞标记， 而非CD3的那些组成。
在用腺病毒和aGalCer共脉冲的B细胞(B/AdHMAxGalCer)处理的组 中的细胞毒性T细胞应答比用转导了腺病毒的B细胞(B/AdHM)处理的组 中的更高并持续得更久，但是差别是不显著的。这些结果表示与 基于肽-脉冲的B细胞的疫苗不同，aGalCer的负载不增强细胞毒性T细胞 应答。但是，与基于转导了腺病毒的B细胞的疫苗不同，施用基于 负载aGalCer的B细胞的疫苗在体内刺激天然杀伤T细胞，并由此活化天 然杀伤细胞(图25)。通过活化天然杀伤细胞和由此诱导细胞毒性T细 胞应答，能够预期抗肿瘤作用。
<10-2>改进基于共负载aGalCer和腺病毒的B细胞的疫苗的疫苗作用
为了研究所述B细胞疫苗诱导细胞毒性T细胞应答的效率，本发明人 以未达最佳标准的剂量施用所述细胞疫苗，并且然后测量靶细胞的裂解， 所述未达最佳标准的剂量不足以诱导完全的细胞毒性T细胞应答。阳性对 照组用负载aGalCer和细胞毒性T细胞表位肽的B细胞(BAxGalCer/pep)处 理。用各种B细胞疫苗免疫后1周，在分别用B/AdHM和B/AdHM/aGalCer 处理的组之间比较诱导细胞毒性T细胞应答的效率(图26)。在施用了 B/aGalCer/pep的组中，认为大多数B细胞呈递抗原，但是仅有占总数20% 的用腺病毒转导的B细胞能够作用为抗原呈递细胞。因此，判定用腺病毒 转导而引入完整抗原的B细胞疫苗能够有效地诱导抗原-特异性细胞毒性 T细胞应答，即使剂量高于肽-脉冲的B细胞疫苗的剂量。此外，当施用
30少量B细胞(达不到有效剂量)时，其也能够在由负载的aGalCer活化的 天然杀伤T细胞的帮助下诱导靶细胞裂解。
实施例11:转导了腺病毒的B细胞疫苗诱导抗原-特异性抗体应答
基于转导了腺病毒的B细胞的疫苗具有同时诱导体液免疫应答和细胞 -介导的免疫应答的优势，这与肽-脉冲的B细胞疫苗仅诱导细胞-介导的免 疫应答不同。为了证实转导了 AdHM的B细胞疫苗是否能够诱导Her-2/weM 特异性抗体，分别用B/AdHM和B/AdHM/aGalCer免疫BALB/c小鼠。为 了测量血清中抗-Her-2Mew抗体的滴度，通过流式细胞计数法研究了抗体 与TAUF细胞，即在其表面上表达Her-2/"w的鼠科肿瘤细胞的结合。
为了测量抗体应答，通过眼部采血，在从免疫作用起第l、第3、第5 和第7周制备血液样品。将小鼠血液样品静置于室温下2小时，随后在 8,000离心10分钟，从而分离血清。为了测量血清中抗-Her-2/"ew抗体的 滴度，从1:50开始，每次两倍地连续稀释该血清(用含有1%FBS，0.09% 叠氮化物的PBS)，随后与TAUF，即表达Her-2Mw的肿瘤细胞一起在4°C 培养60分钟。用缓冲液清洗与小鼠血清一起培养过的TAUF细胞，随后 通过利用FITC-标记的山羊抗-小鼠IgG抗体作为第二抗体，对与TAUF细 胞结合的小鼠抗体进行染色。然后，通过流式细胞计数器(FACSCaliber， BD 生物科学(BD Biosciences))测量与TAUF结合的小鼠抗体的量，并且通 过标准化首次用于实验的小鼠血清和将增高了大于1.8倍的平均荧光强度 认作阳性应答，来计算抗体的滴度。
作为结果，与诱导细胞毒性T细胞的结果一致，在用 B/AdHM和B/AdHM/aGalCer免疫的组中的抗-Her-2/"ew抗体的滴度维持 高水平(图27)，并且在以上两组中也诱导了体液免疫应答，这与用B 细胞和B/aGalCer处理的组中不同(图28)。
实施例12:由用基于负载ctGalCer的转导了腺病毒的B细胞的疫苗的免疫 引起的对癌症的预防和治疗作用将2 x 105个TAUF细胞注射到BALB/c小鼠，即Her-2/"ew肿瘤模型 的尾静脉中，从而诱导肿瘤。然后，用B细胞疫苗免疫携带肿瘤的小鼠， 随后研究存活率。
本发明人检查了转导了腺病毒的B细胞疫苗是否能够一起诱导细胞-介导的免疫应答和体液免疫应答，并由此具有抗肿瘤活性。将TAUF细胞 静脉内注射到小鼠中，从而诱导肺癌，在其中测量所述B细胞疫苗的预防 和治疗作用。为了免疫作用，以浓度2 x 10S施用B细胞疫苗，并且7天 后，将2xl()S个肿瘤细胞静脉内注射到小鼠中，随后研究存活率。与仅用 B细胞(B)处理的组相比，用负载aGalCer的B细胞(BAxGalCer)和转导 了腺病毒的B细胞(B/AdHM)处理的组中的存活期得到了延长，其中所 述转导了腺病毒的B细胞表达肿瘤抗原。当用负载(xGalCer的转导了 腺病毒的B细胞疫苗(B/AdHM/aGalCer)免疫小鼠时，小鼠在试验中始终存 活，其中所述B细胞表达肿瘤抗原。这些结果显示B/AdHM/aGalCer疫苗 具有比B/aGalCer或B/AdHM疫苗更好的抗肿瘤作用(图29，上图)。 并且，判定由所述B细胞疫苗诱导的免疫应答能够有效的防止肿瘤生长。
其次，为了证实所述B细胞疫苗的治疗作用，将51104个肿瘤细胞 (TAUF)注射到尾静脉中，从而诱导肺癌。3天后，用分别1 x 1()S个B 细胞、B/aGalCer、 B/AdHM和B/AdHMAxGalCer免疫该小鼠组。在仅用B 细胞处理的组中观察到最短的存活时间，且B/ccGalCer组的存活时间与之 相似。同时，与仅用B细胞和B/aGalCer处理的组中的那些相比，用 B/AdHM疫苗免疫的组的存活时间得到稍微的延长。相反，用 B/AdHMAxGalCer免疫的组中的存活时间显著延长，这与预防模型的结果 一致，这说明了 B/AdHMAxGalCer疫苗具有比B细胞、 B/aGalCer或B/AdHM疫苗更好的抗肿瘤作用(图29，下图)。
配制实施例制备可注射的溶液
制备本发明抗肿瘤疫苗的可注射溶液如下。
将1 - 2吗/ml (xGalCer， 5 x 106个细胞/ml的B细胞，1-2 (ig/ml肽， 1 g 5'-氯-3,2'-二羟基査耳酮或5'-氯-2,3'-二羟基查耳酮氢氯化物，0.6 gNaCl和O.l g抗坏血酸溶解到蒸馏水中，由此产生100ml用于注射的溶液。 将该溶液倒入瓶中，所述瓶在12(TC灭菌30分钟。
工业适用性
如前文所解释，本发明的B细胞不仅将细胞毒性T淋巴细胞应答诱导 到与常规DC疫苗诱导的相似的水平，并且具有对实体瘤和转移性肿瘤的 预防和治疗作用，其中所述B细胞负载了天然杀伤T细胞配体，具体地是 (xGalCer，和抗原。用编码肿瘤抗原的腺病毒转导的B细胞能够诱导抗原 特异性免疫应答，以致由B细胞介导的疫苗能够用作肿瘤的预防剂和治疗 剂。另外，本发明的疫苗甚至能够在没有CD4+T细胞的帮助下，诱导免 疫应答。因此，能够将其有效地施用于感染HIV的患者中，所述患者具有 由于缺乏CD4+T细胞引起的免疫缺陷。
本领域的那些技术人员应该理解，在前述描述中公开的观念和具体的 实施方案可以容易地用作改进或设计实施本发明的相同目的的其它实施 方案的基础。本领域的那些技术人员还应该理解，这样的等价实施方案没 有背离在后附的权利要求中提出的本发明的精神和范围。
权利要求
1. 一种免疫治疗和预防性疫苗，其由负载天然杀伤T细胞的配体的B细胞、配体和抗原共-脉冲的B细胞或表达负载配体的抗原的B细胞介导。
2. 按照权利要求1的免疫治疗和预防性疫苗，其中所述天然杀伤T 细胞的配体是选自由下列各项组成的组中的 一 项 a-galacturonosylceramide、 a-glucuronosylceramide、磷月旨酰肌醇四甘露糖苷、 异球三己糖基神经酰胺、神经节苷脂GD3、磷脂酰胆碱、卩-半乳糖基神经 酰胺、脂磷酸聚糖、糖基肌醇磷脂(glycoinositol phospholipid )、 aGalCer 衍生物(3-异头半乳糖基神经酰胺和a-异头半乳糖基神经酰胺、细菌脂质抗 原和aGalCer变体。
3. 按照权利要求1的免疫治疗和预防性疫苗，其中所述抗原源自病原 体或肿瘤抗原，所述病原体包括致病细菌、病毒和寄生虫。
4. 按照权利要求3的免疫治疗和预防性疫苗，其中所述病原性细菌来源的抗原是选自由下列各项组成的组中的一项百日咳博德特氏菌 (Bordetellapertussis)抗原(百日咳毒素、丝状血凝素和pertactin)、破伤 风类毒素、白喉抗原(白喉类毒素)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)抗 原(血清组A,B,C,Y和W-135的荚膜多糖)、肺炎球菌属抗原(3型肺炎 链球菌(Streptococcuspnemoniae)荚膜多糖)、结核抗原、霍乱抗原(霍乱毒 素B亚基)、葡萄球菌抗原(葡萄球菌肠毒素B)、志贺氏菌属(shigella) 抗原(志贺氏菌属多糖)、疏螺旋体属物种(Borreliasp.)抗原、白色念珠 菌(Candidaalbicans)抗原和症原虫(Plasmodium)抗原。
5. 按照权利要求3的免疫治疗和预防性疫苗，其中所述病毒来源的抗 原是选自由下列各项组成的组中的一项流感病毒抗原(血凝素和神经氨 酸酶抗原)、人乳头状瘤病毒(HPV)抗原(糖蛋白)、疱疹性口炎病毒抗 原(疱疹性口炎病毒糖蛋白)、巨细胞病毒(CMV)抗原、肝炎病毒抗原(甲型 肝炎(HAV),乙型肝炎(HBV),丙型肝炎(HCV), 丁型肝炎(HDV)和庚型肝 炎(HGV)抗原)(核心抗原和表面抗原)、呼吸道合胞病毒(RSV)抗原、单纯 疱疹病毒(HSV)抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原(GP-120、 GP-160、 p18、 Tat、 Gag、 Pol和Env)和它们的组合。
6. 按照权利要求3的免疫治疗和预防性疫苗，其中所述肿瘤抗原是选自由下列各项组成的组中的一项HPVE6/E7、 gp100、酪氨酸酶、TRP-1 (酪氨酸酶-相关蛋白-l)、 TRP-2(酪氨酸酶-相关蛋白-2)、 MAGE、 MUC-1、 CEA(癌胚抗原)、p53， oc-甲胎蛋白和Her-2/朋w。
7. 按照权利要求1的免疫治疗和预防性疫苗，其中所述抗原特征性地 以肽、脂多糖、多糖、糖蛋白或多核苷酸的形式存在。
8. 按照权利要求1的免疫治疗和预防性疫苗，其中所述抗原是通过用 重组病毒的转导而表达的。
9. 按照权利要求8的免疫治疗和预防性疫苗，其中所述重组病毒是选 自由下列各项组成的组中的一项腺病毒、腺伴随病毒、反转录病毒、痘 苗病毒、痘病毒和新培斯病毒，从而引入编码抗原的基因。
10. 天然杀伤T细胞活化剂，其是由负载aGalCer的B细胞介导的。
11. 细胞毒性反应诱导剂，其是由负载otGalCer的表达肿瘤抗原的B 细胞介导的。
全文摘要
本发明涉及用于预防和治疗疾病的基于B细胞的疫苗，所述B细胞负载了天然杀伤T细胞的配体，和抗原，更准确地，由负载了α-半乳糖基神经酰胺的B细胞介导的免疫治疗和预防性疫苗，所述α-半乳糖基神经酰胺是一种能够刺激天然杀伤T细胞的糖脂。本发明的疫苗组合物能够有效地用作抗肿瘤免疫治疗剂。其中的B细胞，不仅诱导与常规地基于树突细胞的疫苗所诱导的相似水平的细胞毒性T淋巴细胞应答，并且还具有对实体瘤和迁移肿瘤的预防和治疗作用，所述B细胞与树突细胞相比，是容易获得的。
文档编号A61P37/00GK101426523SQ200680054355
公开日2009年5月6日 申请日期2006年4月27日 优先权日2006年4月27日
发明者姜昌律, 郑渊硕, 金娟政, 金炳皙, 高圣悦, 高贤政 申请人:财团法人首尔大学校产学协力财团