蛋白sFRP-5在治疗银屑病的药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分泌型卷曲相关蛋白-5在制备免疫调节功能药物中的应用，特别是在制备治疗银屑病药物中的应用。
【背景技术】
[0002]银屑病(psoriasis)是一种常见的免疫相关性、复发性的皮肤慢性炎症，其特征是真皮内浓密的以T细胞、DC、自然杀伤T细胞和巨噬细胞为主的炎性细胞浸润。银屑病患者皮肤的表皮过度增生且无法正常分化，使其表皮显著增厚、结痂增多[I]。银屑病的确切发病原因还不明确，环境因子(诸如感染、外伤、压力等)和遗传因子等综合因素决定了个体的易感性。银屑病目前尚无根治的药物[2]，早期治疗多使用类固醇等非生物性的免疫抑制剂，此类非专一性免疫抑制剂具有相当程度的副作用。近年来，生物制剂如肿瘤坏死因子制剂Etaner^pt (依那西普)等也被用于银屑病治疗，此类药物多为人源化抗体，用于阻隔银屑病相关炎症细胞因子与受体间的作用。由于许多炎症细胞因子在机体正常免疫反应中不可缺少，没有选择性地阻挡炎症细胞因子亦会导致用药后的副作用，停药后疾病容易反弹。我国从1984年以来约有超过400万患者被诊断为银屑病，自主研究开发我国有知识产权的治疗银屑病的新药物势在必行。
[0003]Wnt信号通路广泛存在于多种细胞和动物体内，具有高度保守的特点，其功能最常见于胚胎发育和癌症，但也参与成年动物的正常生理过程。fct信号通路的失调可能会引起细胞命运、细胞极性、组织模式和细胞增殖等生物学过程的异常，并且与包括癌症在内的许多疾病密切相关[3，4]。Wnt信号通路的激活依靠wnt蛋白与靶细胞表面卷曲受体家族结合，有时也同时结合其它辅助受体，从而开启下游一系列不同信号转导途径。目前被广泛接受的wnt信号转导途径主要有三类，即经典的Wnt/beta-catenin通路、ffnt/Ca2+通路和细胞极性通路。生理条件下生物体自身有多种方式调控fct通路，防止其过度激活。比如通过分泌抑制剂干扰wnt蛋白和细胞表面受体的相互作用，继而阻止信号的产生。这类抑制剂中比较常见的有三类:分泌型卷曲相关蛋白(secreted frizzled related protein,SFRP)、Dickkopf 蛋白(DKK)和 wnt 抑制因子(wnt inhibitory factor, WIF)。其中，SFRP是最早被确认的一类rat抑制剂。这类蛋白含有大约300个氨基酸，并具有一个类似受体Frizzled蛋白的半胱氨酸富集区(cysteine rich domain, CRD),这种结构上的相似性可能是SFRP能够竞争性地结合wnt的原因。目前为止共发现5个哺乳动物的SFRP分子，它们在多种胚胎和成体组织中表达，表明在多种不同的组织和细胞中SFRP家族广泛地发挥着抑制wnt通路被过度激活的作用。
[0004]然而银屑病患者的病变皮肤样本的全基因组芯片数据显示，和患者非皮损部位皮肤相比，sfrp和dkk表达降低，倍数差异分别是0.38和0.43倍[5]。我们取咪喹莫特诱导的小鼠类银屑病模型的病变皮肤，通过提取皮肤中的RNA进行real time PCR检测，发现sfrp家族表达量都有降低趋势,其中sfrp-5的含量更是显著降低(P = 0.0173)。这说明银屑病的发生和发展可能伴随着以wnt抑制信号表达降低为代表的wnt通路的激活。在我们的研究中发现，小鼠类银屑病造模过程中通过皮内注射的方式连续给与重组SFRP-5蛋白，7天造模期结束后，和注射PBS的对照组相比，表皮的厚度和真皮中淋巴细胞浸润数量都有显著降低。实验结果显示SFRP-5对小鼠类银屑病有一定治疗/预防作用。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种蛋白质类大分子化合物SFRP-5在制备抑制细胞增殖功能药物、制备具有免疫调节功能及制备治疗银屑病的药物中的应用。
[0006]本发明的技术方案是:
[0007]该蛋白质分子SFRP-5的制备方法，包括以下步骤:
[0008]I) PCR法扩增小鼠sfrp-5基因；
[0009]2)构建 pcDNA3.1-HA-SFRP5 的表达载体；
[0010]3)将表达载体转染到CHO细胞系中进行重组蛋白表达；
[0011 ] 4)通过蛋白质A/D微球纯化法对重组蛋白进行纯化；
[0012]5)通过荧光素酶检测反应测量它在HEK293T中能够抑制β -catenin的活化比例来确定其活性；
[0013]该蛋白质大分子化合物SFRP5—级结构如下:
[0014]mwvawsarta alalllgalh gaptrgqeyd yygwqaeplh grsyskppqc ldipadlplchtvgykrmrl pnllehesla evkqqasswl pilakrchsd tqvficslfa pvcldrpiyp crslceavragcaplmeayg fpwpemlhch kfpldndlci avqfghlpat appvtkicaq cemehsadgl meqmcssdfvvkmrikeiki dngdrkliga qkkkkllkag plkrkdtkkl vlhmkngasc pcpqldnltg sfivmgrkvegqlIltavyr wdkknkemkf avkfmfsypc slyypffyga aeph
[0015]蛋白质大分子化合物SFRP-5在制备抑制细胞增殖功能药物中的应用。
[0016]蛋白质大分子化合物SFRP-5在制备具有免疫调节功能的药物中的应用。
[0017]蛋白质大分子化合物SFRP-5在制备治疗银屑病的药物中的应用。
[0018]本发明公开的蛋白质大分子化合物SFRP-5对小鼠类银屑病发生、发展的抑制作用是由本发明首次报道。
【附图说明】
[0019]图1.类银屑病小鼠模型的建立:咪喹莫特诱导前后；
[0020]图2.类银屑病小鼠模型的建立:病理切片诱导前后；
[0021]图3.sfrp家族在正常小鼠皮肤和类银屑病小鼠皮肤中的表达；
[0022]图4.sfrp4和sfrp5在健康人和银屑病患者皮肤中的表达；
[0023]图5.SFRP-5在正常小鼠皮肤和类银屑病小鼠皮肤中蛋白水平的表达；
[0024]图6.皮内注射蛋白质大分子化合物SFRP-5 (I μ g/ml)
[0025]A.小鼠皮内注射蛋白质大分子化合物SFRP-5 (I μ g/ml)和对照PBS的同时使用咪喹莫特诱导H&E病理结果；
[0026]B.表皮面积和真皮淋巴细胞的浸润；
[0027]图7.皮内注射不同浓度蛋白质大分子化合物SFRP-5
[0028]A.小鼠皮内注射0.5 μ g/ml、l μ g/ml和15 μ g/ml蛋白质大分子化合物SFRP-5和对照PBS的同时使用咪喹莫特诱导后表皮面积比较；
[0029]B.小鼠皮内注射0.5 μ g/ml、l μ g/ml和15 μ g/ml蛋白质大分子化合物SFRP-5和对照PBS的同时使用咪喹莫特诱导后真皮淋巴细胞浸润数目比较。
【具体实施方式】
[0030]1.类银屑病小鼠模型的建立及鉴定:
[0031]将小鼠麻醉后背部剃毛，面积1.5cm*2