淀粉胚乳特异非表达启动子nse及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种淀粉胚乳特异非表达启动子NSE及其应 用。
【背景技术】
[0002] 在植物基因工程中，对以种子，果实为主要收获产物的植物，利用种子无表达启动 子驱动目的基因仅在茎，叶等绿色组织中表达，而在种子食用部分无表达，是提高转基因食 品安全性的有效策略。
[0003] 目前与植物种子不表达相关国内外专利举例如下：（1)【申请号】201210202831. 8 : 一种柑橘的绿色组织特异启动子；（2)【申请号】200710051443. 3 :组织特异性表达启动子 PD540及其在水稻改良中的应用；（3)【申请号】01823070.9 :营养生长特异性启动子及由此 而得的基因重组植物；（4)【申请号】96104811. 5, 一种豆荚内特异表达毒蛋白的转基因植 物；（5) W00077223: -PROMOTER ENABLING TRANSGENE EXPRESSION IN THE WHOLE PLANT EXCEPT IN THE SEED. (6)US2004117876: - Vegetative growth-specific promoter and genetically modified plants obtained thereby. (7)
[0004] CN102417906: - rice green tissue-specific promoter PD540-544, not expressed in embryos and endosperms. (8)W02008081478: - Chimeric promoter constructed by fusion of GhrbcSP and D35SP promoters(expressed in all tissues except seed endosperm)。这些专利为转基因植物的应用提供了有利启动子工具，但是由 于不同专利涉及不同的启动子，其表达谱（即具体的表达部位和表达水平）存在明显差异； 而且同一个启动子应用在不同的单，双子叶植物，甚至不同物种间时经常有不同的表达效 果。因此现有的启动子资源难以满足植物基因工程的实际需求。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种DNA片段。
[0006] 本发明提供的DNA片段，为如下1)或2)或3)的DNA分子：
[0007] 1)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0008] 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；
[0009] 3)与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。
[0010] 上述严格条件可为在0.1 XSSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C条件下 杂交并洗膜。
[0011] 含有上述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护 的范围。
[0012] 上述重组载体为将上述DNA片段替换掉表达载体pCAMBIA-1300-SGN中的CaMV35S 启动子，得到的重组载体。
[0013] 所述重组载体具体为将上述DNA片段取代pCAMBIA-1300-SGN的PstI和BamHI酶 切识别位点间的小片段（CaMV35S启动子）得到的重组质粒。
[0014] 扩增上述DNA片段的全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。
[0015] 上述引物对由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链 DNA分子组成。
[0016] 上述DNA片段在植物中启动目的基因表达中的应用也是本发明保护的范围。
[0017] 上述应用中，所述目的基因表达为组织特异表达。
[0018] 上述应用中，所述组织为除种子淀粉胚乳以外的其他植物组织。
[0019] 上述应用中，所述除种子淀粉胚乳以外的其他植物组织为1)或2) :1)种子的胚、 糊粉层或种皮；2)植物的根、叶鞘、茎、茎节、叶或穗。
[0020] 上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为水 稻；
[0021] 所述目的基因为⑶S基因。
[0022] 单子叶植物水稻种子的结构包括种皮、胚和胚乳，其中胚乳又分为糊粉层 (aleurone layer)和淀粉胚乳（starchy endosperm)。在水稻加工成大米的过程中，种皮 和果皮、胚以及胚乳的糊粉层都被破坏，而淀粉胚乳留下食用。
[0023] 本发明的实验证明，本发明克隆得到启动子NSE，NSE启动子驱动目的基因仅在淀 粉胚乳之外的部分高效表达，是国内外首个淀粉胚乳特异非表达启动子，将其运用于以淀 粉胚乳为主要收获产物的作物中，对外源基因（如抗除草剂、抗病虫害等）进行选择性表达， 既能节约能量，也能提高大众对转基因粮食的接受。另外，水稻，玉米等作物种子的糊粉层 中不仅富含蛋白质、B族维生素及矿质元素（P、K、Mg)，也是赤霉素信号反应因子及α -淀粉 酶合成的关键部位。NSE启动子在糊粉层中的高表达特性对作物育种中提高种子萌发率，改 良种子品质等具有重要应用意义。
【附图说明】
[0024] 图1为植物表达载体的构建及转NSE:⑶S水稻的⑶S染色分析
[0025] 图2为转NSE:⑶S水稻种子的⑶S染色分析
[0026] 图3为转NSE:⑶S水稻干种子及种子萌发过程中的⑶S染色分析
【具体实施方式】
[0027] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0028] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0029] 实施例1、水稻NSE启动子的获得
[0030] 通过 CTAB 方法从水稻'日本晴'（Oryza sativa ssp. japonica cultivarNipponbare,记载在 Yuman Zhang, Yongsheng Yan, Lina Wang, Kun Yang, Na Xiao,Yunfeng Liu,Yaping Fu, Zongxiu Sun,Rongxiang Fang, Xiaoying Chen. A novel rice gene, NRR responds to macronutrient deficiency and regulates root growth. Mol. Plant，2012, 5(1) :63-72.公众可从中国科学院微生物研究所获得。）叶片中提取基因 组 DNA，设计 了正、反向特异引物 NSE-S-Ns i : 5 ' -ATGCATGCCCTGGCTAGCTTCTTCATCACTTC-3 ' (序列 2) ;NSE-R-BH:5' -GGATCCGGCCTGCACCGCAAATGGCGGATTTCC-3'（序列 3)(带下划线的 碱基为分别引入的NsiI和BamHI限制性酶切位点），采用TaKaRa LA-Taq DNA聚合酶进行 PCR扩增，得到2, 208bp的PCR产物。将该PCR产物送去测序，结果将该PCR产物所示的DNA 分子命名为NSE，该DNA分子的核苷酸序列为序列表中序列1。
[0031] 实施例2、水稻NSE启动子的功能验证
[0032] 1、重组载体的获得
[0033] 将实施例1得到的PCR产物经NsiI和BamHI酶切，得到2, 208bp的酶切产物，将该 酶切产物与经过PstI(与NsiI是同尾酶)和BamHI酶切的植物表达载体pCAMBIA-1300-SGN (记载在 Yuman Zhang, Yongsheng Yan, Lina Wang, Kun Yang, Na Xiao, Yunfeng Liu, Yaping Fu, Zongxiu Sun, Rongxiang Fang, Xiaoying Chen. A novel rice gene, NRR responds to macronutrient deficiency and regulates root growth.Mol. Plant,2012, 5(I):63-72. 公众可从中国科学院微生物研究所获得。该载体中驱动GUS基因表达的启动子为35S)连 接，得到重组载体。
[0034] 采用引物NSE-S-Nsi和NSE-R-BH对重组载体进行PCR检测，得到2, 208bp产物的 为阳性重组载体。阳性重组载体送去测序，结果该重组载体为将序列表中序列1所示的DNA 分子NSE插入表达载体pCAMBIA-1300-SGN的PstI和BamHI酶切位点间（替换掉CaMV35S 启动子）得到的载体，命名为P130-NSE。该重组载体的部分结构示意图如图IA所示，可以 看出，NSE插入⑶S基因的上游。
[0035] 2、重组菌的获得
[0036] 将上述1得到的重组载体pl30-NSE转入根癌农杆菌EHA105 (记载在 Yuman Zhang,Yongsheng Yan, Lina Wang, Kun Yang, Na Xiao,Yunfeng Liu, Yaping Fu, Zongxiu Sun, Rongxiang Fang, Xiaoying Chen. A novel rice gene, NRR responds to macronutrient deficiency and regulates root growth.Mol. Plant,2012, 5(I):63-72. 公众可从中国科学院微生物研究所获得。）中，得到重组菌。
[0037] 提取重组菌的质粒,送去测序,该质粒为pl30_NSE,含