有该质粒的重组菌命名为 EHA105/pl30-NSE。
[0038] 3、转NSE:⑶S水稻的获得
[0039] 1)转NSE:⑶S水稻的获得
[0040] 将重组菌 EHA105/pl3〇-NSE 转入水稻'日本晴'（Oryza sativa ssp. japonica cultivar Nipponbare,也称为野生型水稻）中，得到30株Ttl代转NSE:⑶S水稻。
[0041] 2)转NSE:⑶S水稻的分子鉴定
[0042] 提取Ttl代转NSE:⑶S水稻叶片的基因组DNA，用引物⑶S-S1705 : 5 '-TGGCCAATGGTGATGTCAGCGTT-3' 和⑶S-R2329:5 '-TCCGGTTCGTTGGCAATACTCC-3' 进行 PCR扩增，得到625bp的为阳性，得到30株阳性Ttl代转NSE:⑶S水稻。
[0043] 从阳性Ttl代转NSE:⑶S水稻上收获T1代种子，播种、培育，并通过潮霉素（50ug/ ml)抗性筛选得到了 T2代转基因纯系种子。后续实验均以T2代转NSE:⑶S水稻纯系种子 为实验材料进行NSE启动子分析。
[0044] 米用同样的方法，将空载体 pCAMBIA1300vector (Fisher Scientific catalog NO. 50-513-40,载体中没有⑶S插入）转入野生型水稻中，得到Ttl代转空载体水稻，收种 (T 1代）、播种、培育，得到T2代转空载体水稻纯系，按照上述方法对其进行PCR鉴定，未得到 625bp的产物。
[0045] 采用同样的方法，将载体pCAMB I A-1300-SGN转入野生型水稻中，得到Ttl代转 pCAMBIA-1300-SGN水稻，收种（T1代）、播种、培育，得到T2代转pCAMBIA-1300-SGN水稻纯 系（阳性对照)，PCR鉴定（同样用引物⑶S-S1705和⑶S-R2329进行扩增，得到625bp的为 阳性)。
[0046] 4、转NSE:⑶S水稻的⑶S表达特性分析
[0047] 采用⑶S组织染色方法检测NSE启动子驱动⑶S报告基因在水稻中的表达特性：
[0048] 下述实验采用的水稻为7个独立的T2代转NSE:⑶S水稻纯系（NSE)、T 2代转空载 体水稻（阴性对照，Vec)、野生型水稻（WT)和T2代转pCAMBIA-1300-SGN水稻（阳性对照，或 35S)，每个株系5株，实验重复三次。
[0049] ⑶S 染色液配方：0· IM Na3PO4, ρΗ7· 0, IOmM EDTA, 0· 5mM KjFe(CN)6], 0· 5mM K4[Fe(CN)6]，LOmM X-Glucuronide，0· l%Triton X-IOO 和 10%Me0H。
[0050] I) NSE驱动⑶S在水稻植株的特异表达
[0051] 将处于开花期T2代转NSE:⑶S水稻纯系、野生型水稻（WT)植株的叶鞘、茎、茎节、 叶和穗分别取样后，浸入⑶S染色液中，在0. 08Mpa真空下保持3min，37°C染色过夜，然后用 75%乙醇脱色三次。
[0052] 结果如图IB所示，表明T2代转NSE:⑶S水稻纯系由NSE启动子驱动⑶S在叶鞘、 茎、茎节、叶和穗这些绿色组织中均有明显的蓝色信号。
[0053] 野生型水稻（WT)没有蓝色信号。
[0054] 用同样的方法检测阴性对照和阳性对照，阴性对照组织无蓝色信号，阳性对照组 织全部有蓝色信号。
[0055] 2) NSE驱动⑶S在种子的淀粉胚乳特异非表达特性
[0056] A、初步检测
[0057] 在T2代转NSE:⑶S水稻纯系（NSE)、T2代转空载体水稻（阴性对照，Vec)、野生型 水稻（WT)种子不同发育时期取样，具体分别在开花后17天（17DAF)、35天（35DAF)、45天 (45DAF)收集种子，剥去颖壳后，进行GUS染色。
[0058] 结果如图IC所示，可以看到，T2代转NSE:⑶S水稻纯系（NSE)在种皮、糊粉层中有 很强的GUS信号，而淀粉胚乳中无信号，也就是NSE驱动GUS选择性地在水稻淀粉胚乳以外 的部分高表达。
[0059] T2代转空载体水稻（阴性对照，Vec)和野生型水稻（WT)的种子中无⑶S信号。
[0060] 用同样的方法检测阳性对照，阳性对照在整个组织包括淀粉胚乳部分均有蓝色信 号。
[0061] 由于禾本科作物(水稻、玉米、小麦等）的食用部分均为种子的淀粉胚乳部分，NSE 启动子驱动目的基因选择性地在淀粉胚乳以外的部分高表达，能在转基因作物中增强抗逆 性、提1?广量的同时，提1?其食品安全性。
[0062] B、进一步检测
[0063] 在T2代转NSE:⑶S水稻纯系（NSE)、T2代转空载体水稻（阴性对照，Vec)、T 2代转 pCAMBIA1300-sgn水稻（阳性对照）开花后30天（30DAF)的种子进行⑶S染色。具体操作： 将生长发育中的水稻种子先剥离颖壳后进行纵向切割，或者剥离淀粉胚乳外部的种皮和糊 粉层后，迅速进行GUS染色。
[0064] 结果如图2所示，其中，A，E为T2代转空载体水稻（Vec)阴性对照；B，C和F为 T2代转NSE:⑶S水稻（NSE)种子，其中C为剥离种皮和糊粉层后的⑶S染色；D为T2代转 pCAMBIA-1300-SGN水稻（阳性对照）;染色结果表明T2代转NSE:⑶S水稻（NSE)在糊粉层和 胚中有明显的GUS信号，而白色的淀粉胚乳中GUS无表达；此结果进一步确认了 NSE驱动 GUS在种子淀粉胚乳中不表达，而在非淀粉胚乳的糊粉层和胚中高表达特性。
[0065] 阳性对照全部都有信号，阴性对照都没有信号。
[0066] 3)在种子萌发时NSE驱动⑶S的表达
[0067] 将T2代转NSE:⑶S水稻纯系（NSE)、T2代转空载体水稻（阴性对照，Vec)、T 2代转 pCAMBIA-1300-SGN水稻（阳性对照）的干种子（自然干燥)分别剥去颖壳，横切后进行⑶S染 色，结果如图3所示，T 2代转NSE = GUS水稻纯系（NSE)仅在糊粉层中有强的蓝色信号，而淀 粉胚乳是白色的，没有GUS信号。阳性对照全部都有信号，阴性对照都没有信号。
[0068] 将上述各水稻的干种子在水中浸泡3天时，剥去颖壳后进行GUS染色，结果如图3 所示，T 2代转NSE: GUS水稻纯系（NSE)除了在糊粉层中有明显的GUS信号外，在萌发的芽中 也有强的GUS信号，而淀粉胚乳中是白色无 GUS信号。阳性对照全部都有信号，阴性对照都 没有信号。
[0069] 将上述各水稻的干种子在水中浸泡7天时，将萌发得到水稻植株进行GUS染色， 结果如图3所示，阳性对照全部都有信号，阴性对照都没有信号，T 2代转NSE:⑶S水稻纯系 (NSE)植株的根和地上部分均有较强的蓝色信号，与CaMV35S启动子驱动的⑶S信号相似。
[0070] 综上所述，DNA分子NSE为启动子，且在除种子淀粉胚乳外其他组织中均高效表 达。
【主权项】
1. 一种DNA片段，为如下1)或2)或3)的DNA分子： 1)序列表中序列1所不的DNA分子； 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子； 3)与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。
2.含有权利要求1所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求1所述DNA 片段替换掉表达载体pCAMBIA-1300-SGN中的CaMV35S启动子，得到的重组载体。
4.扩增权利要求1所述DNA片段的全长或其任意片段的引物对。
5.根据权利要求4所述的引物对，其特征在于：所述引物对由序列表中序列2所示的 单链DNA分子和序列表中序列3所不的单链DNA分子组成。
6.权利要求1所述DNA片段在植物中启动目的基因表达中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述目的基因表达为组织特异表达。
8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述组织为除种子淀粉胚乳以外的其他植 物组织。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述除种子淀粉胚乳以外的其他植物组织 为1)或2) :1)种子的胚、糊粉层或种皮；2)植物的根、叶鞘、茎、茎节、叶或穗。
10. 如权利要求6-9中任一所述的应用，其特征在于： 所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻； 所述目的基因为GUS基因。
【专利摘要】本发明公开了一种淀粉胚乳特异非表达启动子NSE及其应用。本发明提供了一种DNA片段，为如下1）或2）或3）的DNA分子：1）序列表中序列1所示的DNA分子；2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3）与1）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。本发明的实验证明，本发明克隆得到启动子NSE，NSE启动子驱动目的基因仅在淀粉胚乳之外的部分高效表达，将其运用于以淀粉胚乳为主要收获产物的作物中，对外源基因（如抗除草剂、抗病虫害等）进行选择性表达，既能节约能量，也能提高大众对转基因粮食的接受。
【IPC分类】C12N15-84, C12N5-10, C12N1-21, C12N15-11, C12N15-113
【公开号】CN104726453
【申请号】CN201310712099
【发明人】方荣祥, 陈晓英, 张玉满
【申请人】中国科学院微生物研究所
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2013年12月20日