种子盾片及叶细脉特异启动子pc2及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种种子盾片及叶细脉特异表达启动子PC2 及其应用。
【背景技术】
[0002] 在作物种子萌发过程中，胚乳中的营养物质通过盾片输送至胚，供胚萌发形成新 植株，盾片是种子萌发相关的酶及激素分泌的关键部位。在单子叶植物水稻的遗传转化系 统中成熟胚的盾片是广泛应用的转化外植体，盾片内相关基因的表达水平将影响水稻不同 品种的转化率。因此分离并鉴定盾片特异表达基因及其相应的启动子，有利于实现对种子 萌发与休眠的有效调控，在作物制种和粮食储存中均具有重要应用价值；也利于提高水稻 优良品种的遗传转化效率，从而加快其育种进程。
[0003] 另外，单子叶植物，如水稻叶细脉（leaf small vein)是韧皮部装载（phloem loading，即光合同化物从叶肉细胞运出至筛管）的关键部位，与光合产物的合成运输、氨 基酸及营养元素尤其氮的循环利用及运输关系密切。因此叶细脉特异表达启动子是研究韧 皮部装载及营养元素运输机制的有利调控元件，通过调控植物光合产物的高效输出从而提 高生物产量。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种DNA片段。
[0005] 本发明提供的DNA片段，为如下1)或2)或3)的DNA分子：
[0006] 1)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0007] 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；
[0008] 3)与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。
[0009] 上述严格条件可为在0.1 XSSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C条件下 杂交并洗膜。
[0010] 含有上述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护 的范围。
[0011] 上述重组载体为将上述DNA片段替换掉表达载体pCAMBIA-1300-SGN中的CaMV35S 启动子，得到的重组载体。
[0012] 所述重组载体具体为将上述DNA片段取代pCAMBIA-1300-SGN的HindIII和BamHI 酶切识别位点间的小片段（CaMV35S启动子）得到的重组质粒。
[0013] 扩增上述DNA片段的全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。
[0014] 上述引物对由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链 DNA分子组成。
[0015] 上述DNA片段在植物中启动目的基因表达中的应用也是本发明保护的范围。
[0016] 上述应用中，所述目的基因表达为组织特异表达。
[0017] 上述应用中，所述组织为盾片和/或叶细脉。
[0018] 上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻。
[0019] 上述应用中，所述目的基因为⑶S基因。
[0020] 叶细脉（leaf small vein):单子叶植物水稻的叶脉为直出平行脉，叶片上的中脉 (midrib)和侧脉（large vein)都自叶片的基部发出，大致互相平行，至叶片的顶端汇合。 主脉和侧脉之间又有细脉（small vein)。
[0021] 本发明的实验证明，本发明克隆得到启动子PC2,其可以驱动目的基因如⑶S在水 稻的盾片和叶细脉中特异表达，从而实现对种子休眠与萌发以及营养物质运输效率的有效 调控。本发明涉及的PC2是禾本科植物首次获得的叶细脉特异表达启动子，具有重要理论 研究意义和应用价值。
【附图说明】
[0022] 图1为P130-PC2植物表达载体的构建示意图及转基因水稻的⑶S染色分析
[0023] 图2为转PC2:⑶S水稻干种子及种子萌发过程中的⑶S染色分析
【具体实施方式】
[0024] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0025] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026] 实施例1、水稻PC2启动子的获得
[0027] 通过 CTAB 方法从水稻'日本晴'（Oryza sativa ssp. japonica cultivar Nipponbare,记载在 Yuman Zhang, Yongsheng Yan, Lina Wang, Kun Yang, Na Xiao, Yunfeng Liu，Yaping Fuj Zongxiu Sun, Rongxiang Fang, Xiaoying Chen. A novel rice gene, NRR responds to macronutrient deficiency and regulates root growth. Mol.Plant, 2012, 5 (I) : 63-72.公众可从中国科学院微生物研究所获得。）叶片中提取基因组DNA，设计 了正、反向特异引物C2-Pro5-H3:5 '
[0028] -AAGCTTACAGCATTTCCCACGGTTATCA-3'（序列 2) ;C2-pro3_Bgl: 5'
[0029] -AGATCTAGGAGTTTAGGACACTAATCAC~3,(序列3)(带下划线的碱基为分别引入的 HindIII和BglII限制性酶切位点），采用TaKaRa LA-Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。
[0030] 得到2, 086bp的PCR产物，将该PCR产物送去测序，结果将该PCR产物所示的DNA 分子命名为PC2,该DNA分子的核苷酸序列为序列表中序列1。
[0031] 实施例2、水稻PC2启动子的功能验证
[0032] 1、重组载体的获得
[0033] 将实施例1得到的PCR产物经HindIII和BglII酶切，得到2, 086bp的酶切 产物，将该酶切产物与经过HindIII和BamHI (与BglII为同尾酶）酶切的植物表达载 体 pCAMBIA-1300-SGN (记载在 Yuman Zhang, Yongsheng Yan, Lina Wang, Kun Yang, Na Xiao, Yunfeng Liu, Yaping Fu, Zongxiu Sun, Rongxiang Fang, Xiaoying Chen. A novel rice gene, NRR responds to macronutrient deficiency and regulates root growth. Mol. Plant，2012, 5(1) :63-72.公众可从中国科学院微生物研究所获得。该载体中驱动⑶S 基因表达的启动子为35S)连接，得到重组载体。
[0034] 该重组载体用引物C2-Pro5-H3和C2-pro3-Bgl进行PCR检测，得到2, 086bp扩增 产物的为阳性重组载体。阳性重组载体送去测序，结果该重组载体为将序列表中序列1所 示的DNA分子PC2插入植物表达载体pCAMBIA-1300-SGN的HindIII和BglII酶切位点间 (替换掉35S启动子)得到的载体，命名为pl30-PC2。该重组载体的部分结构示意图如图IA 所示，可以看出，PC2插入⑶S基因的上游。
[0035] 2、重组菌的获得
[0036] 将上述1得到的重组载体P130-PC2转入根癌农杆菌EHA105 (记载在 Yuman Zhang,Yongsheng Yanj Lina Wang, Kun Yang，Na Xiao,Yunfeng Liu，Yaping Fuj Zongxiu Sun, Rongxiang Fang, Xiaoying Chen. A novel rice gene, NRR responds to macronutrient deficiency and regulates root growth.Mol. Plant,2012, 5(I) :63-72. 公众可从中国科学院微生物研究所获得）中，得到重组菌。
[0037] 提取重组菌的质粒,送去测序,该质粒为pl30_PC2,含有该质粒的重组菌命名为 EHA105/pl30-PC2。
[0038] 3、转PC2:⑶S水稻的获得
[0039] 1)转PC2:⑶S水稻的获得
[0040] 将重组菌 EHA105/pl3〇-PC2 转入水稻'日本晴'（Oryza sativa ssp. japonica cultivar