刺足根螨依赖解旋酶dna等温扩增快速检测引物、试剂盒、检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种刺足根螨依赖解旋酶DNA等温扩增(HDA)快速检测引物、试剂盒及其检测方法，属生物检测领域。
【背景技术】
[0002]根螨生存能力很强，全年均可发生，群集为害植物地下部，取食植物组织，而且可作为植物病原物的载体，诱发、刺激病原菌发生，与病原菌可以互相促进发生，在田间可致使植物叶片枯黄，植株矮化、凋萎，甚至死亡，在仓库可使植物腐烂，对农作物及花丼等的品质有极大影响；唐菖蒲严重受害时，产量损失高达54.2%-9%。由于根螨能造成严重经济损失，而且一旦定殖即难以根除，澳大利亚、新西兰、美国、日本等国家将该属的多个种列为检疫性有害生物。刺足根螨是根螨属中危害最严重的种类之一，刺足根螨能够危害韭黄、韭菜、葱类、百合、芋、甜菜、马铃薯、唐菖蒲、半夏、贝母等，该螨既有寄生性也有腐生性，同时也有很强的携带腐烂病菌和镰刀菌的能力。近年来，随着进出口产品的增多，螨类检疫越来越重要。我国刺足根螨分布比较广泛，而我国的大蒜、百合、马铃薯等农产品每年出口量连续递增，很多出口目的国家对刺足根螨实行严格检疫甚至列为检疫性对象，因此对刺足根螨的准确、快速检测对保障出口的顺利进行，保护出口商农的经济利益具有重要的意义。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一种刺足根螨依赖解旋酶DNA等温扩增(HDA)快速检测引物、试剂盒及其检测方法，以克服现有形态鉴定等常规技术的不足，从而为生物安全提供科学的依据和指导作用。
[0004]本发明提供的刺足根螨的HDA快速检测试剂盒，包括:
(I)模板预处理反应液1: 0.lumol/L特异性上下游引物CUP1、CNP1,0.lmmol/LTris-HCl,0.lmmol/L DTT，0.25 mmol/L dNTP，dH20，反应液 I 的 pH 7.5。
[0005]SEQ ID NO 1: CUP I 5’ - GAGCCTTTTGGTAGTCTT -3。
[0006]SEQ ID NO 2:CNPI 5’ - CATCTAAACCAACTGTGAA -3。
[0007](2)模板预处理反应液I’: 0.lumol/L特异性上下游引物SUP2、SNP2，0.lmmol/LTris-HCl，0.lmmol/L DTT，0.25 mmol/L dNTP, dH20，反应液 I’ 的 pH 7.5。
[0008]SEQ ID NO 3:SUP2 5’ -ATTATGTATGTGCTCGAG-3 ’。
[0009]SEQ ID NO 4:SNP2 5’ -GCACTTTTCCTTCATGCCAGATT -3’。
[0010](3)阳性对照模板:0.lumol/L DNA模板。
[0011](4)HDA 等温扩增液 II:0.15mg/ml BSA，20mmol/L 乙酸镁，5.5mmol/LATP，0.02U/μ L Exo-Klenow, 2ng/ μ L UvrD 解旋酶，1ng/ μ L MutL, 0.1 ug/ μ L T4gp32，dH20，扩增液 II 的 pH 7.5。
[0012]本发明提供的利用上述试剂盒检测刺足根螨的方法，包括下列步骤: (1)待检螨虫或刺足根螨DNA的提取:
提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/ OD28tl在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/ μ L范围内；
(2)模板预处理:
将装有23 μ L模板预处理反应液I和I ’的反应管分别加入2 μ L待检模板DNA于95°C水浴5 min后迅速放入37°C的水浴中冷却5min ；
(3)HDA等温扩增:
将上述经过处理的模板预处理混合溶液25 μ L分别加入25 μ L扩增液II，64°C加热100min，80°C lOmin，降温至 4°C ；
(4)核酸凝胶电泳检测:
核酸扩增完成后，扩增结果在琼脂糖凝胶电泳检测，如果I和I’反应液均出现10bp单条条带，可以判断为阳性，否则为阴性。
[0013]本发明的试剂盒根据刺足根螨的COI基因序列及18S rDNA基因序列设计引物，引物的设计主要经过与近缘种的对比，选取变异较大的区域设计扩增刺足根螨的HDA等温扩增上下游引物两对，用于增加检测的准确度与特异性。同时对设计的引物进行特异性筛选。本发明采用改进的HDA技术，该技术特异性强，具有与PCR检测方法相似灵敏度，但其阔增速度比PCR快，在30min内就可以检测到扩增，并且不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，检测方法简单、快速，特异性强、灵敏度高，特别适用于基层植保机构及植物产品公司与相关检测部门现场诊断。
【附图说明】
[0014]图1是刺足根螨HDA扩增图谱，其中:M:DL2000marker，1:刺足根螨样品样品在I反应液扩增结果，2:刺足根螨样品样品在I’反应液扩增结果；3:阴性对照；4:空白对照。
[0015]图2是刺足根螨HDA等温扩增特异性检测图，其中:M: DL2000marker ； 1-3:刺足根螨样品在I反应液扩增结果；4:罗宾根螨样品在I反应液扩增结果；5:长毛根螨样品在I反应液扩增结果；6:紫草根螨样品在I反应液扩增结果；7:水芋根螨样品在I反应液扩增结果；8:阴性对照；9:空白对照。I’ -2’:刺足根螨样品在I ’反应液扩增结果；3’:罗宾根螨样品在I ’反应液扩增结果；4’:长毛根螨样品在I’反应液扩增结果；5’:紫草根螨样品在I’反应液扩增结果；6’:水芋根螨样品在I’反应液扩增结果；7’:阴性对照；8’:空白对照。
【具体实施方式】
[0016]本发明的主要原理为在恒温条件下利用生物复制系统的关键组分实现DNA的体外扩增。
[0017]本发明提供的刺足根螨HDA等温扩增快速检测试剂盒，其中包括:
(I)模板预处理反应液1:，0.lumol/L特异性上下游引物CUP1，CNP1,0.lmmol/LTris-HCl,0.lmmol/L DTT，0.25 mmol/L dNTP, dH20，pH 7.5。
[0018]刺足根螨特异性引物1:
CUPl 5’ - GAGCCTTTTGGTAGTCTT -3CNPl 5’ - CATCTAAACCAACTGTGAA -3
(2)模板预处理反应液I’: 0.lumol/L特异性上下游引物SUP2，SNP2，0.lmmol/LTris-HCl，0.lmmol/L DTT，0.25 mmol/L dNTP, dH20，pH 7.5。
[0019]刺足根螨特异性引物2:
SUP2 5’ -ATTATGTATGTGCTCGAG-3’
SNP2 5’ - GCACTTTTCCTTCATGCCAGATT -3’
(3)阳性对