一种抑制人黑色素瘤RNF11基因表达的siRNA的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种抑制人黑色素瘤RNFll基因表达的 siRNAo
【背景技术】
[0002] 黑色素瘤是一种由来源于神经脊的黑色素细胞异常增生而产生的恶性皮肤肿瘤， 具有极高的转移性，而且对一般化疗有抗性。因此尽管黑色素瘤的发病率在皮肤癌中只 排第三位，但它的致死率是最高的，在所有皮肤癌致死的病人中，约有80%的病人死于黑 色素瘤。黑色素瘤在我国的发病率近年来成倍增长，2000年发病率统计仅为0. 2/10万， 2005-2007年我国发病率约1/10万，每年新发病例约2万人，已经成为严重危及我国人民 健康的疾病之一。虽然在黑色素瘤的发病早期，可以通过手术切除来治疗，但是一旦发展到 转移阶段，目前还没有有效的治疗手段。
[0003] RNA干涉（RNA interference)技术是近几年发展起来的一种抑制基因表达的最 有力的工具之一。此技术采用19-23个碱基或发夹状不同长度的双链RNA可使不同类型 细胞的革G向基因表达明显降低，因此，RNAi技术可使基因敲除（knock-down)或使基因沉 默（gene silencing)。这是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默（PTGS， post-transcriptional gene silencing)。这种新兴的生物技术为疾病分子水平的治疗提 供了新的技术和方法，在哺乳动物细胞中建立RNA干涉技术，可以用于研宄某些特定基因 的功能，从而可以解决某些疾病的发病机制，同时对疾病尤其是对肿瘤的治疗也有一定的 应用价值，并且RNA干涉技术所使用的剂量仅为反义寡核苷酸剂量的万分之一左右。另一 方面，若小双链RNA中改变1个核苷酸，就可使该RNAi靶向基因沉默作用消失，这样，就有 可能将这一技术用于抑制某些过度表达基因的表达，而不影响正常基因的表达，因此，利用 RNA干扰技术制备基因药物将是一种有效的途径。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在提供一种抑制人黑色素瘤RNFll基因表达的SiRNA，还提供了该SiRNA 载体的构建方法及其应用。
[0005] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0006] 一种抑制人黑色素瘤RNFll基因表达的siRNA，所述的siRNA为小双链RNA，其正 义链序列为SEQ NO. 1、SEQ NO. 2、SEQ NO. 3、SEQ NO. 4和SEQ NO. 5中任意一个所示的序列。 其反义链序列为与相应正义链序列反向互补的序列。
[0007] 优选的，所述的siRNA的正义链序列为SEQ NO. 1、SEQ NO. 3和SEQ NO. 4。
[0008] 一种抑制人黑色素瘤RNFll基因表达的siRNA的载体，所述载体含有能够产生特 异性抑制人RNFll基因表达的siRNA ;所述的siRNA的正义链序列为SEQ NO. 1、SEQ NO. 2、 SEQ NO. 3、SEQ NO. 4和SEQ NO. 5中任意一个所示的序列。
[0009] 所述一种抑制人黑色素瘤RNFll基因表达的SiRNA的载体的构建方法，包括以下 步骤：
[0010] I) SiRNA对应的DNA序列的合成
[0011] 根据序列表中任何一个siRNA的正义链序列，设计其对应的DNA序列，序列两端引 入酶切位点，所述DNA序列为两条单链，并且两条单链是一对互补序列，设计好的序列经合 成后，通过退火形成双链DNA，退火反应采用常规方法即可；
[0012] 2)pSilencer 3. l-U6-siRNA 载体的构建
[0013] 将pSilencer 3. 1-U6载体进行双酶切，所使用的两个酶与步骤（3)中双链DNA 设计酶切位点时选用的酶相同，回收目的片段，然后将回收的载体与步骤（3)中形成的双 链DNA序列连接，并转化感受态细胞，将筛选得到阳性菌落提取质粒，进行双酶切验证，酶 切验证为阳性的重组质粒进一步测序验证，将经验证正确的重组质粒命名为pSilencer 3. l-U6-siRNA 载体。
[0014] 本发明的另一方面，一种抑制人黑色素瘤RNFll基因表达的siRNA在制备抑制黑 色素瘤转移的药物中的应用，所述的siRNA的正义链序列为SEQ NO. 1、SEQ NO. 2、SEQ NO. 3、 SEQ NO. 4和SEQ NO. 5中任意一个所示的序列。
[0015] -种抑制人黑色素瘤RNFll基因表达的siRNA的载体作为抑制黑色素瘤转移的药 物的应用，所述载体含有能够产生特异性抑制人RNFll基因表达的siRNA ;所述的siRNA的 正义链序列为SEQ NO. 1、SEQ NO. 2、SEQ NO. 3、SEQ NO. 4和SEQ NO. 5中任意一个所示的序 列。
[0016] 本发明提供了一种治疗黑色素瘤的药物，所述的药物的活性成分为：通过RNA干 扰抑制人黑色素瘤RNFll基因表达的siRNA及其载体，所述的siRNA的正义链序列为SEQ NO. 1、SEQ NO. 2、SEQ NO. 3、SEQ NO. 4 和 SEQ NO. 5 中任意一个所示的序列。
[0017] 本发明抑制人黑色素瘤RNFll基因表达的siRNA，可以有效抑制黑色素瘤的体内 转移，为黑色素瘤的治疗提供新的靶点，为治疗黑色素瘤提供了可行的药物。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0019] 实施例1载体构建
[0020] I) siRNA对应的DNA序列的合成
[0021] 根据序列表SEQ NO. 1~2中任何一个siRNA的正义链序列，设计其对应的DNA序 列，序列两端引入酶切位点，所述DNA序列为两条单链，并且两条单链是一对互补序列，设 计好的序列经合成后，通过退火形成双链DNA，退火反应采用常规方法即可。将序列表中任 何一个siRNA的正义链序列打乱但所含A、T、C、G含量不变作为相应siRNA的对照。
[0022] 2)pSilencer 3. l-U6-siRNA 载体的构建
[0023] 将pSilencer 3. 1-U6载体进行双酶切，所使用的两个酶与步骤（1)中双链DNA设 计酶切位点时选用的酶相同，回收目的片段，然后将回收的载体与步骤（1)中形成的双链 DNA序列连接，并转化感受态细胞，将筛选得到阳性菌落提取质粒，进行双酶切验证，酶切 验证为阳性的重组质粒进一步测序验证，将经验证正确的重组质粒分别命名为pSilencer 3.1-U6-RNFll-siRNA 载体-1(SEQ N01)，pSilen cer 3.1-U6-RNFll-siRNA 载体-2(SEQ N02)，pSilencer 3.1-U6-RNFll-siRNA载体-3(SEQ N02)，pSilencer 3.1-U6-RNFll-siRNA 载体-4(SEQ N04)，pSilencer 3.1-U6-RNFll-siRNA 载体-5(SE Q N05)。
[0024] 实施例2黑色素瘤细胞转染
[0025] 1)细胞培养
[0026] 人黑色素瘤细胞株HTP137和M102用含10%胎牛血清及1X105U/L青霉素、 100mg/L链霉素的DMEM培养液，置37、°C 5% CO2培养箱培养，选用对数生长期细胞进行转 染实验。
[0027] 2)细胞转染
[0028] 按照阳离子脂质体Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen)的操作说明进行，将 500 μ L无血清培养液DMEM与8 μ g pSilencer 3. l-U6-siRN A载体充分混和，与脂质体 /DMEM混合物再次混合，将最终混合物加入培养在6cm细胞培养皿的黑色素瘤细胞中，在 37、°C 5% CO2培养箱中继续培养至48h。
[0029] 3)实时荧光定量RT-PCR检测
[0030] 采用Trizol试剂（Invitrogen)按照说明书提取实验各组黑色素瘤细胞的总 RNA，紫外检测仪分别在260nm和280nm波长下检测RNA的浓度及纯度。用逆转录试剂盒 (invitrogen)合成cDNA，以此为模板进行实时荧光定量PCR扩增。RNFllmRNA表达量的分 析采用比较Ct数据法（2_ ΛΛ，进行。每组实验重复3次。
[0031] 4)细胞迀移和侵袭抑制率测定
[0032] 分别用transwell迀移和侵袭实验测定RNFllsiRNA对人黑色素瘤ΗΤΒ137和Μ102 细胞迀移和侵袭的抑制率。在transwell迀移实验中，首先将5 X IO5细胞培养于6孔板中 培养24h后进行转染，转染后48h，用胰酶消化并计数，将I X IO4细胞加入transwell小室 的上室，并在下室加入NIH-3T3conditioned培养基作为化学吸引物，培养24小时后，用溶 解在20%的甲醇中结晶紫固定0. 5h，然后用棉签小心拭去未迀移到小室下方而滞留在小 室上方的细胞，在显微镜下对迀移到小室下方的细胞拍照并计数。transwell侵袭实验与 transwell迀移实验步骤基本相同，只是transwell侵袭实验所用的transwell小室要用 Matrigel包被。细胞迀移和侵袭抑制率（％) =(对照组迀移细胞数一实验组迀移细胞 数）/对照组迀移细胞数X100%。每组实验重复3次。
[0033] 5)统计学处理
[0034] 采用SPSS 17. 0软件包进行分析。数据以均数土标准差（mean土SD)表示，采用 t检验，以P < 0. 05为差异有统计学意义，具体情况见表1。
[0035] 表1 48后实时定量PCR检测各载体对RNFll表达的抑制率[RNFl 1表达的抑制率
[0036]
【主权项】
1. 一种抑制人黑色素瘤RNFll基因表达的siRNA，其特征在于：所述的siRNA为小双链 RNA，其正义链序列为SEQNO. 1、SEQNO. 2、SEQNO. 3、SEQNO. 4 或SEQNO. 5 中任意一个所 示的序列。
2. 权利要求1所述的抑制人黑色素瘤RNFll基因表达的siRNA的载体，其特征在于： 所述载体含有能够产生特异性抑制人RNFll基因表达的siRNA;所述的siRNA的正义链序 列为SEQNO. 1、SEQNO. 2、SEQNO. 3、SEQNO. 4 和SEQNO. 5 中任意一个所示的序列。
3. 权利要求1所述的抑制人黑色素瘤RNFll基因表达的siRNA在制备抑制黑色素瘤 转移的药物中的应用，所述的siRNA的正义链序列为SEQNO. 1、SEQNO. 2、SEQNO. 3、SEQ NO. 4和SEQNO. 5中任意一个所示的序列。
4. 权利要求1所述的抑制人黑色素瘤RNFll基因表达的siRNA的载体作为抑制黑色素 瘤转移的药物的应用，所述载体含有能够产生特异性抑制人RNFll基因表达的siRNA;所述 的siRNA的正义链序列为SEQNO. 1、SEQNO. 2、SEQNO. 3、SEQNO. 4 和SEQNO. 5 中任意一 个所示的序列。
5. -种治疗黑色素瘤的药物，其特征在于：所述的药物的活性成分为：通过RNA干扰抑 制人黑色素瘤RNFll基因表达的siRNA及其载体，所述的siRNA的正义链序列为SEQNO. 1、 SEQNO. 2、SEQNO. 3、SEQNO. 4 和SEQNO. 5 中任意一个所示的序列。
【专利摘要】本发明提供了一种抑制人黑色素瘤RNF11基因表达的siRNA，所述的siRNA为小双链RNA，其正义链序列为SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4和SEQ NO.5中任意一个所示的序列，本发明还公开该siRNA载体，该抑制人黑色素瘤RNF11基因表达的siRNA及其载体用于抑制黑色素瘤的体内转移的用途。本发明siRNA及其载体适于制备治疗黑色素瘤的药物。
【IPC分类】C12N15-113, A61K48-00, A61K31-7088, A61P35-04
【公开号】CN104726456
【申请号】CN201510111302
【发明人】王磊, 杨海杰, 高珊珊, 王勉, 程斌峰, 冯志伟
【申请人】新乡医学院
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月15日