专利名称：抑制自然杀伤细胞活性的强啡肽a的制作方法
技术领域：
本发明提供一种通过服用相应于强啡肽或强啡肽类似物的氨基酸顺序的多肽调节个体免疫系统的方法。这种服用的作用是抑制免疫系统天然杀伤(NK)细胞的细胞毒性活性。
免疫系统的总活性取决于对免疫应答作出贡献的各个组分细胞的活性。
一类免疫细胞，天然杀伤细胞(NK细胞)，能攻击和杀伤诸如肿瘤细胞和感染病毒的正常细胞之类的细胞，NK细胞在身体排斥外来组织方面起很大的作用，并且与骨髓移植体受体中宿主疾病相比，在与移植相关的损伤方面，NK细胞也是重要的一类细胞。在这种一类疾病中，来自移植骨髓的NK细胞被活化并攻击正常的宿主细胞。
NK细胞是大颗粒淋巴细胞的正常群体，这种大颗粒淋巴细胞约为淋巴细胞总数的5%。NK细胞可见于血液、淋巴组织包括，并且是由骨髓衍生的淋巴细胞子集。NK细胞还以枯否氏细胞存在于肝中和胃肠道的派伊尔结中。因为NK细胞是可迁移的，所以还可以见于其他组织中。
对于特定的病毒抗原决定子来说，NK细胞杀伤细胞不是专一的，并且不受MHC分子的限制。要作术语“冷靶抑制”描述该现象，从而一类NK靶细胞同时有效细胞竞争而可以抑制溶解不同类型的NK细胞。
对免疫系统的类鸦片作用近来引起几位研究人员的注意。开始，这种注意是基于下述观察结果海洛因滥用者患有各种致免疫异常，如扩散的淋巴结病(Helperm和Rho，N.Y.StateJ.Med.66:2391-2408，1966)、高血清免疫球蛋白(Cushman&Grrieco，Am.J.Med.54∶320-326，1973;Kreek等人，Ann.Intern.Med.77∶598-602，1972)，淋巴细胞增多症(Kreek，J.Am.Med，Assoc.223∶665-668，1973)，在短期培养时淋巴细胞对有丝分裂原应答降低(Brown等人，Arch.Intern.Med.134∶1001-1006，1974)和生成异常的T细胞玫瑰花结。
最近，Novick等人报导过，与健康的个体和曾维持使用美沙酮并在至少十年内未滥用过药物的个体相比，短效鸦片制剂海洛轩非肠胃滥用者中，大大降低了NK细胞的活性。美沙酮是长效鸦片制剂兴奋剂，它与海洛因(一种强的短效鸦片制剂兴奋剂)有交叉耐受性。Novick等人，J.Pharm.Expt.Ther.，250∶606-610，1989。
有关类鸦片对NK细胞活性影响的试验结果是矛盾的。已报道长期稳定使用美沙酮的病人中NK活性的改善，尽管类鸦片对细胞免疫的某些指标可能有直接的影响。Novick等人，J.Pharm.Expt.Ther.，250∶606-610，1989;Kreak等人，NIDAResearchMonographSeries，96∶192-219，1990;Ochshorn等人，Isr.J.MedSci.，26∶421∶425，1990。曾通过体外研究评价过类鸦片对NK活性的直接影响。几组研究人员曾指示，内源类鸦片β-内啡肽提高体外NK细胞活性，并且可由纳络酮，一种专门的类鸦片拮抗物，将这种作用反转过来(Kay等人，LifeSci，35∶53-59，1984;Mandler等人，J.Immunol，136∶934-939，1986;Mathews等人，J.Immunol，130∶1658-1662，1983)。Met-脑啡肽，另一种类鸦片肽，也似乎能提高NK活性(Faith等人，Immunopathol，31∶412-418，1984;Mathews等人，J.Immunol，130∶1658-1662，1983:Wybran，Fed.Proc.44∶92-94，1985)，然而曾报道过Leu-脑啡肽(Faith等人，Immunopathol，31∶412-418，1984;Mathews等人，J.Immunol，130∶1658-1662，1983;Wybran，Fed.Proc.44∶92-94，1985)，α-内啡肽(Kay等人，LifeSci，35∶53-59，1984;Mandler等人，J.Immunol，136∶934-939，1986)和γ-内啡肽(Kay等人，LifeSci，35∶53-59，1984;Mandler等人，J.Immunol，136∶934-939，1986)的相互矛盾的结果。Met-和Leu-脑啡肽两者都是与类鸦片受体兴奋剂。Laidow等人，J.Biol.Chem.，255∶11908(1980)报道有关外源类鸦片对体外NK活性影响的研究工作更少。在一篇研究报告(Wybran，Fed.Proc.44∶92-94，1985)中报道吗啡能提高NK活性，而在另外两篇研究报告中则不能提高NK活性(Kay等人，LifeSci，35∶53-59，1984;Mandler等人，J.Immunol，130∶1658-1662，1983)。
仅仅当美沙酮的浓度比任何临床使用美沙酮的浓度高许多数量级，或与生命相适应时，才能离体观察到正常受治疗者和保持服用美沙酮的病人的细胞NK活性的抑制作用，Kreek，Ann.N.Y.AcadSci，311∶110-134，1988;Ochshorn等人，Isr.J.Med.Sci，26∶421-425，1990。
强啡肽是一组与脑和脊髓中类鸦片受体高亲合性结合的肽。尽管强啡肽在脑中似乎不止痛，但它们可在脊髓中止痛。强啡肽A(1-17)和它们的13个氨基酸片段强啡肽A(1-13)是它分离的第一类强啡肽(Goldstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76∶6666-6670，1979)，并且表征很好。
US4462941所指的强啡肽类似物具有至少10个氨基酸，但少于13个氨基酸，报导的这种类似物能使宿主耐受麻醉止痛效果增强。
US4481991涉及强啡肽或强啡肽类似物，以及它们在治疗高血压或心脏功能障碍方面的应用。
US4537878、4757049、4801614涉及采用各种类鸦片兴奋剂调节免疫系统的方法。具体地，US4537878报道了，在服用蛋氨酸脑啡肽及个体中NK活性升高和降低。报道服用脑啡肽和相关的组合物，通过刺激T和NK细胞群体都具有调节病毒、细菌、真菌、肿瘤细胞和寄生虫，以及通常与老化相关的所有免疫缺陷的活性。然而，这些专利没有指出或没有提出蛋氨酸脑啡肽或它的确定等效物增加或降低NK活性的结构关系。
以WO92/02507公开的PCT申请PCT/US91/05518涉及通过服用不同量的酸或酰胺形式的强啡肽来刺激或抑制病人免疫系统的方法。报道采用强啡肽的酸或酰胺化形式刺激免疫系统。然而，据报道只有酸形式才通过刺激和抑制其免疫而具有双相作用，据报道强啡肽酰胺化形式不具有双相作用，只观察到免疫刺激作用。
许多免疫功能直接受NK细胞影响。具体地，NK细胞对病毒感染的细胞是第一道防御。NK细胞的这种活性变得复杂，并且可能降低基因治疗的效果，基因治疗是用病毒载体将遗传物质引入个体。令人惊奇的是，评价基因治疗中NK活性作用的研究工作物报道几乎没有。
尽管涉及不同类型病毒载体的各种系统可能是具有新遗传顺序的靶细胞的有效工具，但是几种因素降低了这些载体在提供基因治疗时的效果。例如反转录病毒载体随机结合到细胞基因组中，因此可能打断正在进行的蛋白质合成，或者以通过防止已结合的DNA顺序起作用的方式被插入。反转录病毒也可结合到其他反转录病毒中，因此破坏了两种反转录病毒的已结合的DNA。这种特性造成所要求合成的最终产物水平较低。另外，许多细胞型没有充分与转导期间常使用的延长的体外培养基反应。要继续保持和完成其所要求的功能，原始培养物少到25%也不是不常见的。因此，一旦将该载体施用到需要基因治疗的那些个体时，实际上表达的载体-DNA的量应该能防止任何其他类型也许会降低或没有效果的侵袭。
对于进行基因治疗的个体来说，NK细胞存在很大的问题，典型地，任何水平的病毒感染的作用部分是活化免疫系统，尤其是NK细胞，试图使身体去掉感染的病毒。由于NK细胞对特定的抗原决定子是不专一的，并且为活化不需要在先接触，除了破坏由载体-DNA顺序转导的任何细胞外，对于该免疫系统来主，有可能错将被病毒感染的“自身”分子或者已发生肿瘤样变化的分子当作外来分子。如果感染病毒是一种含所需要的治疗遗传物质的重组病毒并且感染的细胞是对于一些缺失可采用表达转染遗传物质修改的那些细胞，这样一种免疫应答应该不是人们所要求的。因此，由载体-NDA顺序(其中包括但不限于反转录病毒、与腺相关的病毒、牛痘或单纯性疱疹Ⅰ)所感染的全部细胞应该是由NK细胞侵袭的可能靶。
本发明提供一种抑制哺乳动物NK细胞毒性活性的方法。该方法包括给需要治疗的个体使用强啡肽A，其肽具有下述结构。
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa15-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa1015其中1位选自于由酪氨酸、m-酪氨酸和多巴组成的组中。2、3、15、16和17位是中性氨基酸，它们选自于由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和α-氨基异丁酸(AIB)组成的组中。在4位的氨基酸选自于由苯丙氨酸、酪氨酸、α-甲基苯基丙氨酸和其中苯环由对位-取代的斥电子基如卤素或硝基取代的苯丙氨酸组成的组中。5和14位选自于非极性(疏水的)氨基酸组中，它们由异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸组成。
6、7和9位非常优选的是精氨酸，但也可以是负电荷的氨基酸;它们选自由赖氨酸、组氨酸、高精氨酸或鸟氨酸组成的组中，然而9位还右以包括脯氨酸。
在8和12位的氨基酸选自于由酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和赖氨酸组成的碱性和中性氨基酸组中。10位是选自于由脯氨酸、硫代脯氨酸、3，4-去氢脯氨酸、4-羟基脯氨酸和哌可酸组成的组中的碱性氨基酸或脯氨酸类似物。最后在11和13位的氨基酸非常优选的是赖氨酸，但还可以是选自于由组氨酸、高精氨酸或鸟氨酸组成的组中的负电荷氨基酸。
适宜于本发明方法使用的肽的氨基酸可以是d或l形成。
对降低NK活性适宜的强啡肽的羧基末端具有下式
式中aa是第n氨基酸的侧链，n是强啡肽A多肽中的氨基酸总数。R1和R2可以是相同的或不同的，可以是氢、烷基或任意取代的苯甲基，或者如果R1和R2中的一个是含氮部分如酰肼，则另一个是氢。当与提供基因治疗联系起来用于抑制NK活性时，强啡肽A肽也可终止于羧基。
共价连接强啡肽的氨基酸的肽键具有下列结构 式中R3是氢或C1-4烷基，而烷基是直链或支链的。
按照该发明的方法，强啡肽A肽的用量应足以减弱NK细胞的细胞毒活性。优选地，当这种细胞与摩尔浓度为1×10-7至约1×10-2的强啡肽A多肽接触时就可达到这一要求。
可以使用本发明方法治疗哺乳动物，尤其是人，从NK细胞活性降低中人应该得到的好处。本发明方法尤其适用于治疗其NK细胞已被活化的那些个体。本发明还特别适用治疗按受移植组织的个体或预期成为移植组织受体的个体，移植组织如骨髓组织，肝、肾、心脏和肺。其他需要治疗的个体可以包括患有自身免疫疾病的那些个体。
此外，本发明的方法对于治疗需要基因治疗的个体(其中包括用含有治疗基因的病毒或类病毒载体感染这样一种个体)是有用的。当用来进行基因治疗时，为降低NK细胞活性所使用的强啡肽A肽羧酸末端可以如式(2)所述，或可以是羧基。
本发明的一个目的是提供一种抑制体内和当指出时离体NK细胞活性的方法。
另一个目的是提供一种降低移植受体中组织排斥的方法。
还有一个目的是提供一种治疗患有各种自身免疫疾病个体的方法。
另一个目的是提供一种NK对受重组基因感染的细胞的活性的方法。
图1图示说明由强啡肽A(1-17)抑制NK活性的剂量依赖性。
图2图示说明由强啡肽A(1-10)酰胺抑制NK-活性的剂量关系。
图3图示说明了强啡肽A(2-17)，[a];强啡肽A(1-13)，[b]，强啡肽A(1-10)，[c]不抑制NK活性的情况。
本发明提供了一种调节免疫系统组分活性的方法，意外地，根据本发明方法，通过给个体服用具有相应于强啡肽A或强啡肽A类似物的氨基酸顺序的多肽，可以使该个体NK细胞的细胞毒性活性受到抑制。
天然存在的强啡肽A是17个氨基酸肽，它具有下式Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro1510Lys-Leu-Lys-Trp-Asp-Asn-Gln15
在本发明方法中适宜使用的强啡肽A肽及类似物，在其肽氨基酸末端具有氨基酸酪氨酸或酪氨酸类似物。此外，在适用于本发明中的肽的1位，这种氨基酸要求基于我们意外的发现，即强啡肽A(2-17)的浓度在约1μM以上时提高NK活性，而强啡肽A(1-17)的浓度为约0.1μM以上时降低NK活性，分别见图3和1。
式Ⅰ的氨基酸可被各种氨基酸取代。1位的酪氨酸可由m-酪氨酸或二羟基苯丙氨酸(多巴)取代。优选地，1位是酪氨酸。
2、3、15和16位的氨基酸优选为甘氨酸，但可由其他中性氨基酸取代，其中包括但不限于丝氨酸、苏氨酸。半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或α-氨基异丁酸(AIB)。
4位优选为苯丙氨酸，但可以是α-烷基化苯丙氨酸，例如α-甲基苯丙氨酸，酪氨酸或其中苯环用诸如卤素或硝基之类的对位取代的斥电基团取代的苯丙氨酸。
5和14位最优选的是亮氨酸，但可以用其他非极性(疏水的)氨基酸取代，其中包括但不限于异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。在5位更优选的氨基酸是异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸。
6、7、9、11和13位最优选的是精氨酸，但可以是其他负电荷氨基酸，如赖氨酸、组氨酸，高精氨酸或鸟氨酸，在9位的氨基酸也可以是脯氨酸。
8和12位最优选的是异亮氨酸，但也可用碱性或中性氨基酸取代。优选地，8位氨基酸是酪氨酸，亮氨酸、异亮氨酸或赖氨酸。
10位最优选的是脯氨酸，但可以是另一种碱性氨基酸或脯氨酸类似物，如硫代脯氨酸，3，4-去氢脯氨酸，4-羟基脯氨酸或哌可酸。优选地，10位氨基酸是脯氨酸或赖氨酸。
对于天然存在的那些强啡肽A可以被取代的氨基酸可以是d或l形成。
11到17位的氨基酸可除掉或取代，这取决于羧基末端的结构，羧基末端可终止于羧基或选择性取代的酰胺基。中止于羧基的强啡肽类似物的必需具有至少约14个氨基酸的链长。优选地，依据上面提出的原则进行氨基酸11到17的取代，从而用中性氨基酸取代中性氨基酸，碱性氨基酸取代碱性氨基酸，酸性氨基酸取代酸性氨基酸。
优选地，在本发明中适用的强啡肽和类似物的羧基末端具有下式 式中的aa是第n个氨基酸的侧链，并且n是强啡肽多肽中氨基酸总数;R1和R2是相同或不相同的，并且选自于氢、C1-4烷基、选择性取代的苯甲基，或当R1和R2中的一个是含氮部分，如酰肼时，则另一个是氢。更优选地，R1和R2两者都是生成酰胺的氢。
据认为(不受理论束缚)，末端羧基的取代为的是保护氨基末端酪氨酸残基不被降解。
意外地，强啡肽A肽的酰化作用可将不具有NK抑制活性的肽转化成抑制NK活性的肽。例如，我们发现，强啡肽A(1-10)不具有任何抑制NK活性的作用，甚至浓度高达1mM也是如此，见图3。然而强啡肽A(1-10)酰胺的浓度为约100μM以上时导致NK活性显著降低，见图2。当然，使用经过修饰以保护1位氨基酸残基的其他强啡肽A类似物，在本发明方法中也是有用的。
当用来提供基因治疗时，式(2)的结构 还可以是 这种， 结构被羟基取代。
将本发明中可使用的强啡肽A和强啡类似物的氨基酸共价联结起来的肽键具有如下结构氨基酸 氨基酸 (3)式中R3选自于氢或C1-4烷基，其中烷基是直链或支链的。优选地，R3是氢。
强啡肽类似抑制NK活性的能力也是该肽长度的函数。例如，没有酰胺化的酸型强啡肽A(1-10)和强啡肽A(1-13)不抑制NK活性，而强啡肽A(1-17)抑制NK活性。因为观察到强啡肽A(1-10)酰胺的NK抑制作用，所以NK抑制作用不需要强啡肽A(1-17)11至17位的氨基酸，并且若保持NK抑制活性不变，则可以取代或除掉11至17位氨基酸。因此，适宜于按照本发明抑制NK活性的酸型强啡肽A肽和类似物的链长为至少14个氨基酸。优选地，该链长是17个氨基酸。不受理论的束缚，最短的链长是，为保持羧基末端与氨基末端充分分开以便防止因与1位酪氨酸残基相互作用而损失活性所需要的链长。
当强啡肽A肽或类似物是酰胺型的时，最短的链长是能保持NK抑制活性的链长，优选为10-17个氨基酸长度。
包括适用于本发明的天然存在的强啡肽A的各种强啡肽A类似物可活化鸦片制剂受体。活化Kappa鸦片制剂受体是特别优选的。强啡肽A或类似物与Kappa鸦片制剂受体结合可采用标准结合试验测定，这对本技术领域的技术人员来说都是已知的。参见Chaukin，C.等人，Science215∶413(1982)和Jen，M.F.等人，Eur.J.Pharmacology91∶95-99，1983。
已知几种强啡肽A类似物，并在该技术领域已有描述，例如，US4481191(引入本文作参考)描述了强啡肽A酰胺类似物，指出它们适用于治疗心血管疾病。US4462941(也引入本文作参考)描述了强啡肽A酰胺类似物，它们增强了麻醉剂的止痛效果。PCT/US91/05518申请(也引入本文作参考)也描述强啡肽A类似物，指出它们对刺激或抑制免疫系统都是有用的。任上面专利和申请中描述的各种强啡肽A肽和类似物，若它们都满足上述标准的话，则在本发明方法中都是适用的。强啡肽A和强啡肽A类似物都可采用本技术领域的技术人员已知的标准肽合成方法进行合成，这种合成方法如US4462941所描述，该专利引入本文作参考。
本发明的方法适宜于治疗哺乳动物，优选为人，对于哺乳动物和人来说，抑制NK细胞活性应该具有有益的效果。这些人的例子是作为各类组织(尤其是骨髓)的移植受体的那些人;如患有自身免疫疾病的个体一样免疫活性升高的个体和接受或需要基因治疗的个体。自身免疫疾病包括自免疫机能障碍和自身免疫紊乱。这类自身免疫疾病实例包括但不限于红斑狼疮、类风湿关节炎、溶血性贫血、青少年糖尿病、阿狄森病、甲状腺毒症、自身免疫萎缩性胃炎、原发性胆汁性肝硬变和多发性硬化。
在本发明的另一种具体方案中，将强啡肽A和强啡肽A类似物用于需要基因治疗的那些个体。基因治疗可通过将所需要的多肽的遗传顺序插入复制载体，然后将其载体/DNA顺序插入需要治疗个体的特定细胞中，在体内或体外产生大量各种多肽。适于基因治疗的疾病实例包括但不限于胱膀纤维变性、β-地中海贫血、镰形细胞性贫血、肌肉营养不良、类风湿关节炎、糖尿病和各种类型的癌。适于基因治疗的癌实例包括但不限于乳腺癌、结肠癌、加德纳多发性息肉瘤、急性骨髓性白血病、多发性骨髓癌和恶性黑瘤。
为给个体提供基因治疗，将编码与表达所需要蛋白质的特定DNA顺序插入适合的载体复合物中，然后用它感染需要治疗的个体。将所需要的遗传顺序引入个体时可以使用各种方法和载体。优选的和最常用的方法是将所需要的遗传顺序引入反转录病毒的基因组中而形成嵌合体遗传物质。然后可以用在遗传上改变的反转录病毒感染体外或体内的合适靶细胞。优选地，改变反转录病毒，将所需要的顺序插入靶宿主细胞的基因组中并复制，而不复制感染的病毒。通过反转录病毒载体成功的基因转移结果是用病毒感染的宿主细胞，它只表达所需要的基因产物。有关采用反转录病毒载体进行基因治疗的评论可参见WO92/07943(于1992，5，14公开“RetroviralVectorsUsefulforGeneTherapy”)和RichardC.Mulligan的“GeneTransferandGeneTherapy∶Principle，ProspectsandPerspective”，(EtiologyofHumanDiseaseattheDNALevel，Chapter12。JanLinsten和AlfPeterson，eds.RoverPress，1991)，这些都引入本文参考。
基因治疗使用的其他方法可以包括但不限于将载体-DNA复合物改为新的靶区域的化学改性。适于提供基因顺序的附加病毒载体包括但不限于与腺相关的病毒、单纯性疮疹1病毒和牛痘。改性的肝炎B或C病毒和它的δ剂RNA类病毒样结构也可用作针对肝的载体。
人体的与腺相关的病毒(AAV)是一类细小病毒，它自然地整合在人染色体19的特定位置上。可以改变AAV，将AAV末端重复与被克隆的所需遗传顺序结合，然后用作人淋巴细胞基因治疗的载体。复制未修饰的AAV要求与辅助病毒，如腺病毒或单纯性疱疹协同感染，然而，未修饰的AAV角将稳定地整合而没有这些辅助病毒。这种稳定性使AAV成为极好的载体，尤其是对于抵抗或改变血红蛋白病更是如此，这种病是例如(但不限于)镰形细胞性疾病和β-地中海贫血。参见CarlosA.Muro-Cacho等人，“GeneTransferinHumanLymphocytesUsingaVectorBasedonAdeno-AssociatedVirus”(JournalofImmunotherapy11∶231-371(1992))。
重组牛痘病毒也可用于基因治疗。牛痘是一种有大量双股DNA的痘型病毒，并且在宿主细胞胞质中很容易复制。由于牛痘的大DNA结构，所以有能力编码200多种分离的多肽，其中包括对其基因组复制所必需的那些多肽。外源基因可以插入牛痘基因组中，在牛痘复制循环过程中表达该外源基因。牛痘由于具有这样大的复制能力，它有能力同时编码和表达许多基因顺序。这就使得研究人员对于极大的多肽如胰岛素或各种白细胞介素能将整个DNA顺序置于无能力产生必需蛋白质的个体中，或者置于需要化学治疗的那些个体中。牛痘载体的治疗与使用在下述资料中作过叙述Macket，M.和Smith，，G.L.的JournalofGeneralVirology67∶2067-82(1986)和WO92/07944(“VacciniaVectors，VacciniaGenesandExpressionProductsThereof”，1992年5月14日公开)。
单纯性疱疹病毒1(HSV1)也是一种基因治疗中有用的载体。HowardJ.Federoff等人，“ExpressionofNerveGrowthFactorInVivoFromaDefectiveHerpesSimplexVirus.IVectorPreventdEffectsofAxotomyonSympatheticGanglia”，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences89∶1636-1640(1992)。在基因治疗中使用HSV1，主要是因为其先进感染系统。在HSV1-DNA顺序与靶细胞连接后，病毒膜与能使病毒核蛋白壳直接进入胞质的细胞浆膜融合，然后进入宿主细胞核中。基因治疗中使用的HSV1经修饰，以使除填塞位点(PackagingSite)和转录单位之外的所有部分都被除去，然后插入所需要的DNA顺序。基因治疗还可利用化学改性使所选择的载体-DNA(通常为反转录病毒)的传染性改变或改向，而针对具有对所选择化学改性剂来说具有唯一性的受体细胞。此外，可以通过将抗体与各种载体-DNA基因连结起来改变病毒的专一性。常用的抗体是抗MHCⅠ和MHCⅡ。
(MHC＝主要组织相容性复合物。然后这些抗体病毒-DNA复合物将感染带有MHC抗原的细胞，并复制已插入的DNA顺序。参见HiroshaNeda等人的“ChemicalModificationofanEcotropicMurineLeukemiaVivusResultsinRedirectionofIrsTargetCellSpecificity”(JournalofBiologicalChemistry，22∶14143-14146，1991)。
根据本发明的方法治疗需要基因治疗的个体时，通过采用强啡肽A或啡肽A类似物、以足以降低NK细胞的细胞毒性活性的量治疗该个体，来减弱通常抗这种病毒感染的免疫应答。在与嵌合体病毒接触之前，之中或之后都可以如此施用强啡肽A或强啡肽A类似物。
将强啡肽A多肽和强啡肽A类似物施用于需要治疗的个体，其量足以抑制NK细胞的细胞毒性活性。优选地，施用于个体的多肽量应足够达到血液中摩尔浓度为约1×10-7至1×10-2。血液中摩尔浓度为约1×10-6至约1×10-3是比较优选的。按照本发明最优选的方法，使用的多肽量应足够达到血液中摩尔浓度约1×10-5至约1×10-3。因为酸型分裂或降解的可能性很大，当使用酸型多肽抑制NK活性时，优选较高浓度，即1×10-5至约1×10-2M。
可以通过测定血液样品的NK活性来监测治疗效果。NK活性可通过测量NK靶细胞释放标记物进行监测。当通过服用强啡肽A或强啡肽A类似物降低NK活性时，应观察到靶细胞释放的标记物也相应降低。优选地，分析从K 562(ATCC CCL 243)人红白血病细胞(erytholeukerice)中释放的51Cr可以评价NK活性。
如果转导细胞是对强啡肽敏感的，并且因使用转导细胞所见到的治疗效果将由于强啡肽A的存在而受到或遏制，则在把转导引入病人体内之前应中断或降低使用强啡肽A或强啡肽A类似物。强啡肽A的摩尔浓度应适当降低，使该转导细胞保持活性，并且继续其确定的治疗目的。对强啡肽A敏感的转导细胞或许包括T-淋巴细胞、B-淋巴细胞和粒细胞。
根据本发明使用的强啡肽A肽和类似物可以以无菌药组合物形式施用，该组合物还含有在生理上可接受的载体，其中包括但不限于盐水、缓冲液、右旋糖和水。
旋用强啡肽A肽和类似物的方法可以是口服、舌下、静脉内、腹膜内、经皮或鼻内的方法。直接给作用部位局部用药也是合适的。并且可以采用本技术领域中已知方法用药，其中包括但不限于注射，输注和埋植多孔器具(其中装有强啡肽A肽或类似物)。与其他肽的施用相似，优选采用避免与胃肠道接触的方法用药，除非该部位是要作用的部位。若希望用药避免强啡肽A通过肝及其随后降解，那么优选地采用舌下或静脉内的方法或采用其他透粘膜方法用药。
实施例实施例Ⅰ强啡肽A肽和类似物调节体外天然杀伤细胞(NK)抑制作用强啡肽A(1-17)、强啡肽A(1-10)、强啡肽A(1-13)、强啡肽A(2-17)和强啡肽A(1-10)酰胺的NK抑制活性，可通过采用人的红白血病细胞(ATCCCCL243)K 562为靶向体外测量分析51Cr释放来进行测定。采用Ficoll泛影酸盐密度梯度离心法，从新鲜的肝素化血液分离出周围血液单核细胞(PBMC)。该细胞在RPMI 1640培养基中洗涤，该培养基补充了10%牛胎血清、1%L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素、K 562细胞用100μCi51Cr在37℃潮湿的5%CO2气氛下培育90分钟进行标记。PBMC细胞分别用各种浓度的强啡肽和类似物(10-14至10-3M)培育15-30分钟。在培育90分钟后，将K 562细胞洗涤四次，并同PBMC/dyn细胞一起放到复制管中，PBMC/dyn效应基因K 562靶之比为1∶50，最终体积为1ml，在潮湿的5%CO2气氛下培育4小时。用1% Triton X-100溶液溶解洗涤缓冲液和标记的K 562细胞来测定最大51Cr释放。仅用培养基培育标记的K 562细胞来测定自然释放，只用靶细胞培养已标记的K 562细胞来测定基线NK活性。在培育之后，取出0.5ml上清液，并进行放射性计数。用平均值计算细胞毒性如下%细胞毒性＝ (cpm样品-cpm自然)/(cpm最大-cmp自然) ×100观察强啡肽A(1-10)酰胺和强啡肽A(1-17)培育的细胞的NK抑制作用(图1和2)。强啡肽A(1-10)没有引起NK活性任何大的变化(图3)，而强啡肽A(1-13)和强啡肽A(2-17)引起NK活性增加(图3)。
实施例Ⅱ基因治疗转移黑瘤的NK细胞抑制作用在白细胞介素-2和抗新霉素标记物基因(NeoR)反转录病毒转导至人肿瘤的淋巴细胞(TIL)之后，在基因治疗转移黑瘤时完成抑制天然杀伤细胞活性。TIL细胞是淋巴细胞，它渗入固体肿瘤并具有唯一的溶解量，对于自身肿瘤尤其如此。TIL细胞和白细胞介素-2结合起来可介导患有晚期黑瘤的病人肿瘤显著消退，因为白细胞介素-2起作TIL产生的刺激剂的作用。如果白细胞介素-2有基因插入体外TIL细胞，TIL细胞当再引入患有自身肿瘤(如转移黑瘤)的病人是时，由于连续表达白细胞介素-2的结果而将刺激体内产生另外的TIL。TIL细胞活性的这种增强和细胞的补充应增进抗肿瘤细胞的活性，造成肿瘤减少或根除。使用强啡肽A或强啡肽A类似物降低NK活性以提高用病毒转化的TIL细胞的比例，该细胞在NK攻击中仍继续存在。参见Rosenberg，SA等人和“GeneTransferintoHumans-ImmunotherapyofpatientswithAdvancedMelanoma，UsingTumor-InfiltratingLymphocytesModifiedbyRetroviralGeneTransduction”(N.Engl.J.Med.1990，9∶570-578)。
病例记录从患有转移黑瘤病人的肿瘤块切除的组织在培养液中生长，采用下述叙述的技术分离TIL细胞RosenbergSA等人的“Useoftumor-infiltratinglymphocytesandinterLeukin-2intheimmunotherapyofpatientswithmetastaticmelanoma:apreliminaryreport”(N.Engl.J.Med.1988;319:1676-80)和TopalianSL等人的“Expansionofhumantumorinfiltrtinglymphocytesforuseinimmunotherapytrials”(J.Immunol.Methods1987;102:127-41)。
TIL细胞经分离并培养8-19天之后，用Moloney鼠白血病反转录病毒LNL6转导该细胞。在这种Moloney鼠白血病病毒衍生物中，除去gag.pol和env基因，并且插入白细胞介素-2的DNA序列和新霉素磷酸转移酶NeoR基因。这种特异性病毒在gag基因处有突变，这种突变可防止产生任何病毒蛋白质。
采用由LNL6病毒感染的反转录病毒“填塞”细胞系，产生和LNL6病毒粒子PA317/LNL6置于Dulbecco′smodifiedEagle培养基中生长，该培养基含高水平葡萄糖和谷氨酰胺(12-604B，WhittakerBioproducts)以及10%热灭活的胎牛血清(A-1111-L，Hyclone)。采集接近融合的PA317/LNL6培养物上清液、混合、用0.45-μm过滤器过滤、对NIH/3T3细胞滴定，然后在-70℃冷冻，直到马上使用。含反转录病毒的上清液进行需氧菌、厌氧菌和支原体试验、还对淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒进行MAP试验，以及对ecotropicxenotropic和amphatrophic辅助病毒进行StL-试验。根据FDA的要求另外进行小鼠和荷兰猪的一般性安全试验。
TIL细胞培养物中总细胞数一旦达到了细胞数为约1.2-7.6×108细胞时，三分之一至二分之一的TIL细胞与LNL 6上清液接触。在每个瓶装有200ml培养基的800ml组织培养瓶中，在每毫升溶液5μg鱼精蛋白存在下，病毒粒子与细胞的比例范围应该为1.3至2.3。该细胞在病毒粒子存在下于37℃培育2小时。洗涤该细胞，并在每毫升106细胞的密度下传代培养。重复转导步骤，直到回收率达到74-100%。
在TIL细胞输入到病人之前，根据细胞表面标记物的表达采用流动细胞计数筛选各种培养物。还测定它们抗自身肿瘤、异源肿瘤的溶解性质，以及抗对NK敏感的K562和对NK不敏感的Daudi细胞系的铬-51释放试样。对内毒素进行标准的鲎试验，并且进行Southern印迹分析与新霉素磷酸转移酶试验，以证实NeoR基因的存在与表达，并因此证实，成功转导伴随的白细胞介素-2的顺序。
在将已转导的TIL细胞计划引入进行基因治疗的病人之前约两星期，该病人应该开始用强啡肽A肽类似物治疗的疗程。病人接受的强啡肽A或强啡肽A类似物的量应该使血液中的摩尔浓度足以达到约1×10-4至约1×10-3。每1-3小时服用所选择的强啡肽，直到病人输入重组TIL细胞前约48小时，在这个时候停止施用强啡肽A肽或类似物。这样就使TIL细胞与强啡肽A或其类似物接触最少，它们可以直接降低TIL细胞的细胞毒性活性。
在48小时后，或者病人中强啡肽A肽水平达到摩尔浓度低于约1×10-7时，可以将转导的细胞输入病人中。在30至60分钟期间内，输注1-3次，每次200-250ml，每次输注转导TIL/白细胞介素-2最大为2×1011个细胞。
在回收间隔为10-22天后，该病人返回第二个TIL/白细胞介素-2循环，病人再接受强啡肽A肽或类似物的治疗，直到恢复TIL/白细胞介素-2输注前48小时。
开始治疗之后二个月，得到放射照片、扫描图和测定结果以便评价该癌的状况。病人的癌稳定或恶化则要进行第二个疗程。
在治疗过程中，由于有限间隔引入强啡肽A肽或类似物，病人可以获得转导TIL/白细胞介素-2的充分益处，而对再引入的TIL细胞无NK细胞毒性。
与我们在前面已描述许多本发明具体方案的同时，很显然可以改变基本结构以便提供利用本发明方法的其他具体方案。因此，应意识到本发明的范围是由本文所附的权利要求书所限定的，而不是通过前面列出的实施例的特定具体方案所限定。
权利要求
1.一种抑制需要治疗个体的哺育动物NK细胞的细胞毒性活性的方法，其中包括给个体施用具有下述结构的强啡肽A肽Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa15-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa1015其中1位氨基酸选自由酪氨酸、m-酪氨酸和二羟基苯丙氨酸(多巴)组成的组中；2、3、15和16位是选自于由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺和α-氨基异丁酸(AIB)组成的组中的中性氨基酸；4位是选自于由苯丙氨酸、酪氨酸、α-甲基苯基丙氨酸和其中苯环由对位取代的斥电子基如卤素或硝基取代的苯丙氨酸组成的组中的氨基酸；5和14位是选自于由亮氨基酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸组成的组中的非极性(疏水的)氨基酸；6、7、9、11和13位是选自于由精氨酸、赖氨酸、组氨酸、高精氨酸或鸟氨酸组成的组中的负电荷氨基酸，并且其中9位的氨基酸也可以是脯氨酸；8和12位是选自于由酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和赖氨酸组成的碱性或中性氨基酸组中的氨基酸；10位是选自于由硫代脯氨酸、3，4-二氢脯氨酸、4-羟基脯氨酸、脯氨酸和哌可酸组成的组中的碱性氨基酸或脯氨酸类似物；其中氨基酸选自d和l型；并且其中强啡肽A肽的羧基末端具有下式 式中aa是第n个氨基酸的侧链，n是强啡肽A多肽中的氨基酸总数；并且R1和R2是相同的或不同的，它们是氢、C1-4烷基、选择性取代的苯甲基，或者当R1和R2之一是含氮部分如酰肼时，则另一个则是氢，还有，其中强啡肽A肽的氨基酸共价结合在一起的肽链具有下述结构 式中R3是选自于氢或C1-4烷基，并且式中的烷基是直链或支链的；并且其中强啡肽A肽选择性地包括11位、最高到并包括17位的氨基酸；以及其中强啡肽A肽以足以调节NK细胞的细胞毒性活性的量施用。
2.根据权利要求1的方法，其中R1、R2、R3是氢。
3.根据权利要求2的方法，其中酰胺化的强啡肽A肽选自于由强啡肽A(1-10)酰胺、最高到并包括强啡肽A(1-17)酰胺组成的组中。
4.根据权利要求1的方法，其中给个体施用足以达到血液中摩尔浓度为约1×10-7至约1×10-2量的强啡肽A肽。
5.根据权利要求4的方法，其中给个体施用足以达到血液中摩尔浓度为约1×10-6至约1×10-3量的强啡肽A肽。
6.根据权利要求5的方法，其中给个体施用足以达到血液中摩尔浓度为约1×10-5至约1×10-3量的强啡肽A肽。
7.根据权利要求6的方法，其中多肽选自于由强啡肽A(1-17)和强啡肽A(1-10)酰胺组成的组中。
8.根据权利要求1的方法，其中给个体施用强啡肽A肽以便使患有自身免疫疾病的个体NK活性降低。
9.根据权利要求8的方法，其中自身免疫疾病选自于由红斑狼疮、类风湿关节炎、溶血性贫血、青少年糖尿病、阿狄森病、甲状腺毒症、自身免疫萎缩性胃炎、原发性胆汁性肝硬变和多发性硬化组成的组中。
10.根据权利要求9的方法，其中强啡肽A肽1位的氨基酸是酪氨酸。
11.根据权利要求8的方法，其中强啡肽A肽以足以使血液中摩尔浓度达到约1×10-7至约1×10-2的量施用。
12.根据权利要求11的方法，其中给个体施用足以使血液中摩尔浓度达到约1×10-6至约1×10-3量的强啡肽A肽。
13.根据权利要求12的方法，其中给个体施用足以使血液中摩尔浓度达到约1×10-5至约1×10-3量的强啡肽A肽。
14.根据权利要求13的方法，其中所述的强啡肽选自于由强啡肽A(1-10)酰胺和强啡肽A(1-17)酰胺组成的组中。
15.根据权利要求1的方法，其中服用强啡肽以便抑制或降低接受移植组织的个体NK活性。
16.根据权利要求15的方法，其中移植组织选自于由肝、肾、心脏、肺和骨髓组成的组中。
17.根据权利要求16的方法，其中强啡肽A肽1位的氨基酸是酪氨酸。
18.根据权利要求15的方法，其中给个体施用足以使血液中摩尔浓度达到约1×10-7至约1×10-2量的强啡肽A肽。
19.根据权利要求18的方法，其中给个体施用足以使血液中摩尔浓度达到约1×10-6至约1×10-3量的强啡肽A肽。
20.根据权利要求19的方法，其中给个体施用足以使血液中摩尔浓度达到约1×10-5至约1×10-3量的强啡肽A肽。
21.根据权利要求20的方法，其中强啡肽A肽选自于由强啡肽A(1-10)酰胺和强啡肽A(1-17)组成的组中。
22.根据权利要求1的方法，其中给个体施用强啡肽A肽以使降低对给个体服用以提供基因治疗的细胞的NK活性。
23.根据权利要求22的方法，其中强啡肽A肽1位氨基酸是酪氨酸。
24.根据权利要求22的方法，其中施用的细胞是用病毒转导的。
25.根据权利要求22的方法，其中强啡肽A肽以足以使血液中摩尔浓度达到约1×10-7至约1×10-2量的使用。
26.根据权利要求25的方法，其中给个体施用足以使血液中摩尔浓度达到约1×10-6至约1×10-3量的强啡肽A肽。
27.根据权利要求26的方法，其中给个体施用足以使血液中摩尔浓度达到约1×10-5至约1×10-3量的强啡肽A肽。
28.根据权利要求27的方法，其中强啡肽A肽选自于由强啡肽A(1-10)酰胺和强啡肽A(1-17)组成的组中。
29.根据权利要求24的方法，其中给病人施用转导的细胞，以便治疗选自于由膀胱纤维变性、β-地中海贫血、镰形细胞贫血、肌肉营养不良和癌组成的组中的疾病。
30.根据权利要求29的方法，其中癌选自于由乳腺癌、加德纳多发性息肉病、急性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤和恶性黑瘤组成的组中。
31.根据权利要求22的方法，其中在施用作基因治疗的细胞之前施用强啡肽A肽，以及其中使强啡肽A肽的摩尔浓度降至低于一定浓度，在施用作基因治疗的细胞之前，该浓度降低NK细胞的细胞毒性活性。
32.根据权利要求31的方法，其中使强啡肽A肽的摩尔浓度降低到至少约1×10-7水平。
33.根据权利要求32的方法，其中强啡肽A肽1位氨基酸是酪氨酸。
34.一种提供基因治疗的方法，其中包括通过给个体施用具有下述结构的强啡肽抑制需要基因治疗个体中哺乳动物NK细胞的细胞毒性活性Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa15-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa1015其中1位氨基酸选自于由酪氨酸、m-酪氨酸和二羟基苯丙氨酸(多巴)组成的组中;2、3、15和16位是选自于由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺和α-氨基异丁酸(AIB)组成的组中的极性中性氨基酸;4位是选自于由苯丙氨酸、α-甲基苯丙氨酸、其中苯环由对位取代的斥电子基团如卤素或硝基取代的苯丙氨酸和酪氨酸组成的组中;5和14位是选自于由亮氨基酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸组成的组中的非极性(疏水的)氨基酸;6、7、9、11和13位是选自于由精氨酸、赖氨酸、组氨酸、高精氨酸或鸟氨酸组成的组中的负电荷氨基酸，并且其中9位的氨基酸也可以是脯氨酸;8和12位是选自于由酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和赖氨酸组成的碱性或中性氨基酸组中的氨基酸;10位是选自于由硫代脯氨酸、3，4-二氢脯氨酸、4-羟基脯氨酸和哌可酸组成的组中的碱性氨基酸或脯氨酸类似物;其中氨基酸选自d和l型;并且强啡肽A肽的羧基末端是羧基，并且其中将强啡肽的氨基酸共价联结起来的肽键具有下述结构 式中R1选自于氢或C1-4烷基，而烷基是直链或支链的;以及其中强啡肽A肽选择地含15位直到并包括17位的氨基酸，其中以足以减弱NK细胞的细胞毒性活性的量施用强啡肽A肽。
35.根据权利要求34的方法，其中用于进行基因治疗的细胞是由病毒载体转导的。
36.根据权利要求34的方法，其中强啡肽A肽以足以使血液中摩尔浓度达到约1×10-7至约1×10-2的量施用。
37.根据权利要求35的方法，其中强啡肽A肽以足以使血液中摩尔浓度达到约1×10-6至约1×10-3的量施用。
38.根据权利要求37的方法，其中强啡肽A肽以足以使血液中摩尔浓度达到约1×10-5至约1×10-3的量施用。
39.根据权利要求38的方法，其中强啡肽A肽1位氨基酸是酪氨酸。
40.根据权利要求39的方法，其中强啡肽A肽是强啡肽A(1-17)。
41.根据权利要求34的方法，其中将转导的细胞施用于病人以治疗由膀胱纤维变性、β-地中海贫血、镰形细胞性贫血、肌肉营养不良、类风湿性关节炎、糖尿病和癌组成的组中的疾病。
42.根据权利要求41的方法，其中强啡肽A肽是强啡肽A(1-17)。
43.根据权利要求41的方法，其中癌选自于由乳腺癌、结肠癌、加德纳多发性息肉病、急性肌髓性白血病、多发性骨髓瘤和恶性黑瘤组成的组中。
44.根据权利要求34的方法，其中在施用作基因治疗的细胞之前施用强啡肽A肽，以及其中使强啡肽的摩尔浓度降至低于一定摩尔浓度，在施用作基因治疗的细胞之前，该浓度可降低NK细胞的细胞毒性活性。
45.根据权利要求44的方法，其中使强啡肽的摩尔浓度降低到至少约1×10-7水平。
46.根据权利要求45的方法，其中强啡肽A肽1位氨基酸是酪氨酸。
47.根据权利要求46的方法，其中给病人施用转导细胞以治疗选自于由膀胱纤维变性、β-地中海贫血、镰形细胞性贫血、肌肉营养不良、类风湿性关节炎、糖尿病和癌组成的组中的疾病。
48.根据权利要求47的方法，其中癌选自于由乳腺癌、结肠癌、加德纳多发性息肉病、急性肌髓性白血病、多发性骨髓瘤和恶性黑瘤组成的组中。
49.根据权利要求47的方法，其中强啡肽A肽是强啡肽A(1-17)。
全文摘要
本发明提供了一种抑制哺乳动物天然杀伤(NK)细胞的细胞毒性活性的方法。
文档编号C07K14/665GK1096962SQ93121649
公开日1995年1月4日 申请日期1993年12月2日 优先权日1992年12月2日
发明者M·J·克里克 申请人:洛克菲勒大学