专利名称：自然杀伤性t细胞的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种制备自然杀伤性T细胞的方法。
背景技术：
自20世纪90年代始，细胞免疫治疗已成为肿瘤综合治疗的重要手段之一。目前恶性肿瘤的细胞免疫治疗从效应细胞的类型来分主要有二大类，一是天然杀伤细胞(NK细胞)，二是细胞毒T细胞(CTL细胞)。NK细胞的杀伤对象为MHCI类分子丢失/变异的细胞，不需要抗原预先免疫或致敏。自80年代中期以来，文献报道的淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)和CD3抗体激活的杀伤细胞(CD3-AK)等抗肿瘤免疫效应细胞的主要成分是NK细胞。CTL的杀伤对象是表达MHCI类分子的细胞，其产生需要抗原刺激或预先致敏，但杀伤能力明显较NK细胞强。但是，由于肿瘤相关抗原的免疫原性很弱，一般不能用以诱导CTL产生，因而应用CTL治疗肿瘤的报道甚为罕见。目前研究得较多的是用肿瘤相关抗原负载树突状细胞(DC)，通过DC治疗来诱导CTL形成，从而获得疗效。
近年来，国外学者发现人体血液中存在一类具有NK和CTL双重特性的新颖免疫效应细胞，称为自然杀伤性T细胞(简称NKT细胞)。NKT细胞是一类特殊的T淋巴细胞，其含量约占外周血CD3 T细胞总数的5％，主要特征是同时表达T细胞标志(如CD3、CD4、CD8等)和NK细胞受体(如CD16、CD56等)。NKT细胞的产生无需抗原预先致敏，其杀伤对象与NK细胞相似，但其杀伤能力较CIK强10倍左右。有文献报道，NKT是迄今发现的抗肿瘤能力最强的一类免疫效应细胞。
NKT细胞含有若干不同的细胞亚群，目前研究较多的是Vα24 NKT细胞。这类细胞表达Vα24β11 T细胞受体，识别CD1d抗原(α-半乳糖基神经酰胺，α-Galactosylceramide)，对CD1d抗原阳性肿瘤具有显著杀伤作用。此类NKT细胞可以用上述抗原负载的DC和IL-15刺激T细胞在体外大量扩增，但由于其含量仅占外周血CD3 T细胞总数的0.05％，因而在制备上还存在问题。此外，日本学者Ishhara等发现，α-半乳糖基神经酰胺单独刺激T细胞可以诱导出另一类CD3+CD56+NKT(简称CD56 NKT)细胞(Ishhara S，Nieda M，Kitayama J，等人J.Immunol，2000，165(3)1659-1664)。进一步研究发现此类细胞可以用混合白细胞培养上清液+CD3抗体诱导扩增。临床资料显示，给化疗后复发的白血病患者输入MHC I类抗原不相关的健康人CD56 NKT细胞后，可以产生显著的移植物抗白血病(GVL)效应，使得一部分患者再次获得缓解(Gritzpis AD，Dimitroulopoulos D，Parakevas E，等人CancerImmunol Immunothera，2002，51(8)440-448)。
但是，上述CD56 NKT细胞的制备技术不稳定，不同批号的混合白细胞培养上清液获得的NKT细胞含量差异很大。因此，迫切需要提供一种新的NKT细胞的制备方法。本发明者通过实验研究，发现通过用细胞因子IFNγ替代混合白细胞培养上清液可以获得高纯度的CD56 NKT细胞。体外实验证明，NKT细胞对多种NK不敏感的实体肿瘤(包括肺癌)细胞具有显著的杀伤能力。这表明此类NKT细胞在肿瘤治疗中具有广泛的应用潜能。
发明内容
为了达到本发明的目的，本发明提供了一种自然杀伤性T细胞的制备方法，该方法包括下列步骤a)使从癌症患者获得的T淋巴细胞在干扰素γ作用下培养6-48小时；b)加入CD3抗体和白细胞介素-2培养2-10天；c)将细胞转移至含白细胞介素-2的培养液中，培养7-14天；d)获得自然杀伤性T细胞。
在本发明的一个实施方案中，所述从癌症患者获得的T淋巴细胞是指从癌症患者(较佳为肺癌患者)的外周血或癌性浆膜腔积液中分离获得的T淋巴细胞。
在分离获得癌症患者的T淋巴细胞后，可将其培养在培养液中。本发明所用的培养液可采用本领域技术人员熟知的培养此类细胞的常规培养液，其包括但不局限于，RPMI 1640培养液(Gibco)。
在本发明的方案中，加入的干扰素γ宜为重组人干扰素γ，其加入的浓度为200-2000U/ml，更佳的为500-1500U/ml，最佳的为1000U/ml左右。加入干扰素γ，培养淋巴细胞至少6小时，以使其充分与干扰素γ作用。培养时间宜为6-48小时，较佳的为24小时。
然后，在淋巴细胞培养液中加入CD3抗体和白细胞介素-2。加入CD3抗体的浓度宜为0.1-1.0μg/ml，加入白细胞介素-2的浓度为100-1000U/ml。在一个最佳的方案中，更加入CD3抗体的浓度为0.1μg/ml，加入白细胞介素-2的浓度为500U/ml。加入CD3抗体和白细胞介素-2后，培养细胞2-10天，较佳的培养7天。随后，将细胞转移至含100-1000U/ml白细胞介素-2的培养液中再培养7-14天，从而获得自然杀伤性T细胞。
发明人通过研究出人意料地发现，通过在CD3和白细胞介素-2诱导前先用人干扰素γ诱导，可获得以自然杀伤性T细胞为主的细胞表型。而且，NKT细胞不仅存在于肺癌病人的血液中，而且还可以从癌性浆膜腔积液中诱导出来。体外杀伤试验证明，从癌性浆膜腔积液中诱导获得的NKT细胞对多种肺癌细胞具有非常高的杀伤能力。因此，应用肺癌病人的浆膜腔积液(胸水)诱导获得NKT细胞进行免疫治疗，可以起到物尽其用、变废为宝的作用。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规试验条件进行。
实施例1外周血及癌性浆膜腔积液中NKT细胞的诱导材料与方法1)外周血及癌性浆膜腔积液健康人外周血(作为对照)上海血液中心提供，HBV，HCV，HIV及梅毒检测阴性。
癌症病人外周血及浆膜腔积液来自临床住院病人，经知情同意后由护士按医嘱采集。
2)试剂RPMI 1640培养液，购自GIBCO公司。
淋巴细胞分离液(比重1.077)，购自上海试剂二厂。
人AB血清，购自上海血液中心，HBV，HCV，HIV及梅毒检测阴性。
抗人CD3单抗，购自美国PharMingen公司。
重组人白介素-2(白细胞介素-2)，购自上海华新生物高技术公司。
重组人γ-干扰素(IFN-γ)，购自美国R&D公司。
3)淋巴细胞分离外周血(或浆膜腔积液)与生理盐水按1∶1的体积比混合，2000rpm离心10分钟后，吸去上面的液体，加入生理盐水制成细胞悬液。
取10ml淋巴细胞分离液，置于消毒离心管内，将10ml细胞悬液小心地加到淋巴细胞分离液上，2000rpm离心20分钟后，收集界面细胞，用生理盐水离心洗涤1次，重悬细胞于含10％AB血清的RPMI 1640培养液中。
4)CIK细胞的诱导在6孔板内加入1×106淋巴细胞(5ml培养液)，37℃ 5％ CO2条件下培养24小时。次日，分别加入0.1-1.0μg/ml CD3抗体及100-1000U/ml白细胞介素-2，培养1周后将细胞移到培养瓶内，用含100-1000U/ml白细胞介素-2的培养液继续培养1-2周。
5)NKT细胞的诱导在第1天培养时加入500-1500U/ml IFNγ，37℃ 5％ CO2条件下培养24小时。次日，分别加入0.1-1.0μg/ml CD3抗体及100-1000U/ml白细胞介素-2，培养1周后将细胞移到培养瓶内，用含100-1000U/ml白细胞介素-2的RPMI 1640培养液继续培养1-2周。
6)免疫表型分析取1×106细胞(200μl培养液)，置于消毒离心管内，分别加入1μg荧光素FITC标记的抗CD3，CD4，CD8，CD16，CD45RA，CD45RO，CD56，HLA-DR抗体，室温避光放置30分钟，用3ml生理盐水离心洗涤2次后，流式细胞仪检测。
7)细胞毒分析在96孔板中加入5×103肺癌细胞(100μl培养液)及不同比例的淋巴细胞(100μl培养液)，37℃ 5％ CO2条件下培养4小时。1500rpm离心5分钟后每孔吸取100μl上清，转移至96孔板中，按乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(美国Biovision公司产品)说明书要求检测细胞毒。
8)结果1.CD3抗体及白细胞介素-2含量对细胞增殖的影响淋巴细胞在体外培养7-21天，细胞增殖能力与白细胞介素-2含量呈正相关。加入CD3抗体后细胞增殖能力明显增强(表1)。实验结果显示，0.1μg/ml CD3抗体+500U/ml白细胞介素-2培养3周是较为合理的培养条件。
表1 CD3抗体及白细胞介素-2剂量对细胞增殖的影响
2.IFNγ对细胞增殖的影响在培养第1天加入不同剂量IFNγ后，在2周内明显影响细胞增殖，但2周后细胞增殖能力显著增强(表2)。实验结果显示，1000U/ml IFNγ、0.1μg/ml CD3抗体以及500U/ml白细胞介素-2培养3周是最佳培养条件。
表2 IFNγ对细胞增殖的影响
3.IFNγ对细胞表型的影响比较CD3抗体/白细胞介素-2与IFNγ/CD3抗体/白细胞介素-2二种培养条件所得细胞的抗原表型，发现CD3抗体/白细胞介素-2培养(CIK细胞)以CD8+T细胞为主，而IFNγ/CD3抗体/白细胞介素-2培养以NKT细胞为主，其主要特征是同时表达CD3，CD8和CD56(表3)。
一种优选技术方案，其特征在于所述5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物序列如下
表4外周血和浆膜腔积液中NKT细胞的免疫表型比较
5.CIK细胞及NKT细胞对肺癌的杀伤能力比较比较CIK和NKT细胞对肺癌细胞的杀伤能力，发现经IFNγ诱导产生的NKT具有较强的杀伤能力(结果表5)。
表5 CIK及NKT细胞对肺癌的杀伤能力
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
权利要求
1.一种自然杀伤性T细胞的制备方法，其特征在于，该方法包括下列步骤a)使从癌症患者获得的T淋巴细胞在干扰素γ作用下培养6-48小时；b)加入CD3抗体和白细胞介素-2培养2-10天；c)将细胞转移至含白细胞介素-2的培养液中，培养7-14天；d)获得自然杀伤性T细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入干扰素γ的浓度为200-2000U/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入CD3抗体的浓度为0.1-1.0μg/ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入白细胞介素-2的浓度为100-1000U/ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入干扰素γ的浓度为1000U/ml。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入干扰素γ后培养24小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入CD3抗体的浓度为0.1μg/ml，加入白细胞介素-2的浓度为500U/ml。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述T淋巴细胞来自外周血或癌性浆膜腔积液。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌症患者为肺癌患者。
全文摘要
本发明提供了一种自然杀伤性T细胞的制备方法，该方法包括a)使从癌症患者获得的T淋巴细胞在200－2000U/ml的干扰素γ下培养6－48小时；b)加入CD3抗体和白细胞介素－2培养2－10天；c)将细胞转移至含白细胞介素－2的培养液中，培养7－14天；d)获得自然杀伤性T细胞。用本发明方法可获得高纯度的对多种NK不敏感的实体肿瘤细胞有显著杀伤作用的自然杀伤性T细胞。
文档编号A61K35/14GK1635114SQ20031012450
公开日2005年7月6日 申请日期2003年12月30日 优先权日2003年12月30日
发明者蒋锦琪, 董强刚 申请人:蒋锦琪, 董强刚