专利名称：自然杀伤性t细胞在角膜移植中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，更具体地涉及自然杀伤性T细胞(NKT)用于治疗角膜移植免疫排斥反应的用途。
背景技术：
角膜盲目前仍是我国主要的致盲眼病之一，对于其中绝大多数患者，穿透性角膜移植是唯一有效的复明手段。由于角膜本身没有血管，加之存在前房相关免疫偏离(Anterior Chamber Associated ImmuneDeviation，ACAID)，使角膜处于相对免疫赦免状态，因此在圆锥角膜、大泡性角膜病变、角膜营养不良等植床上进行的穿透性角膜移植，术后免疫排斥反应发生率低，约为10％。而对于角膜新生血管化、粘连性角膜白斑、二次或多次角膜移植、角膜化学烧伤、单纯疱疹病毒感染等情况下，角膜和前房的屏障功能被破坏，术后排斥率高达65％，称为高危角膜移植，是严重影响手术成功的关键因素，是临床治疗的棘手问题。而在我国，约有超过200万例角膜盲患者需要进行角膜移植，其中有相当多的属于高危角膜移植范畴。例如，北京同仁医院眼科(1992年-2001年)进行的1789例穿透性角膜移植患者中，有35.2％的患者属于高危角膜移植患者(high-risk keratoplasty patients)范畴，其中包括角膜新生血管化、粘连性角膜白斑、角膜移植术后植片混浊、角膜化学烧伤、年幼患者、眼前节手术、联合玻璃体切除术、单纯疱病毒感染等。因此，在我国供体材料十分匮乏的情况下，大量等待手术复明的高危角膜移植患者和术后高排斥率之间的矛盾表现更加突出，需要有更加有效的抗排斥反应的药物来控制。免疫抑制剂主要用于器官移植和一些具有T细胞亢进的自身免疫病的患者如依赖性糖尿病、类风湿关节炎、丙型肝炎等，以防止移植后器官被机体排斥和缓解自身免疫病。到目前为止，接受过器官移植的患者通常需要终身使用免疫抑制剂，而长期用药会带来对免疫系统抗感染和抗肿瘤作用的损伤。
目前，角膜移植免疫排斥反应的治疗主要依靠术后使用免疫抑制剂，糖皮质激素是临床上广泛应用的药物，虽然价格相对低廉，但长期应用会引起青光眼、白内障等更加严重的后果；新型免疫抑制剂的研究已经将CsA、FK506等推向临床，但长期应用除费用昂贵外，所引起的肝肾损伤、感染以及肿瘤等副作用仍是不容忽视的问题。因此，寻找有效、应用方便、副作用小的免疫治疗方法仍是亟待解决的问题。
在器官移植中，移植物要在受体中长期存活，最终需要达到免疫耐受状态。多种免疫调节细胞在其中发挥重要作用，目前自然杀伤性T细胞(nature killer T cell，NKT)的功能已引起人们的极大关注。NKT细胞是新发现的第四类淋巴细胞，与T细胞、B细胞和NK细胞具有不同的细胞表型和功能，其最显著的特征是同时表达T细胞表面受体(TCR)和NK细胞表面标志。NKT细胞的另一重要特征是CD1限制性。CD1是与MHC-I类分子结构相似，而抗原提呈功能却类似MHC-II类分子的第三类抗原提呈分子，NKT细胞只识别由CD1d分子递呈的脂类抗原，人工合成的α-半乳糖神经鞘胺醇(α-galactosylceramide，α-GalCer)及其类似物OCH等能以CD1d限制的和TCR介导的方式激活NKT细胞。
NKT细胞可以在肝脏、脾脏以及外周血中检测到，但在不同部位分布极不均衡。目前对人类NKT细胞的研究大部分局限于外周血，Kadowaki等已经从脐带血和成年人血中成功诱导培养出NKT细胞。
NKT细胞具有多种生物学功能，既产生Th1型的细胞因子如IL-2和IFN-γ，也产生Th2型细胞因子如IL-4和IL-10，还可产生CD8+T细胞分泌的细胞因子如穿孔素，颗粒酶等。因此，目前多数学者认为，NKT细胞是具有双重作用的细胞，其调节作用主要依赖于它在免疫起始阶段所接受的刺激。
然而，在本申请之前，还没有将NKT细胞直接用于治疗角膜移植免疫排斥反应。发明人经过长期研究发现，将NKT细胞用于治疗角膜移植免疫排斥反应，可明显延长角膜植片的存活时间，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的一个方面是提供自然杀伤性T细胞(NKT)在制备治疗哺乳动物器官移植免疫排斥反应药物中的用途，其中，所述的器官移植包括角膜移植、心脏移植、肾移植、胰岛移植、皮肤移植等，优选地是角膜移植，更优选地是高危角膜移植；其中，该抗排斥反应药物可用于哺乳动物，其中哺乳动物选自人、猴、狗、猫、大鼠、小鼠等，更优选地，所述的哺乳动物是人。
本发明的另一个方面是提供含有NKT细胞的药物组合物，其含有有效量的NKT细胞和药学上可接受的载体，例如缓冲液、培养液、防腐剂等。NKT细胞可从哺乳动物的脾脏、肝脏、外周血中分离，并经过体外培养扩增获得，或者从脐带血和外周血中分离并经培养扩增获得。
本领域技术人员可以理解，本发明的药物组合物适用于各种给药方式，例如静脉内给药、结膜下给药等。若有特殊治疗要求，本发明的药物组合物还可包含其他活性药理成分，例如抗生素等，这种相伴使用有利于治疗。
在本发明的药物组合物中。NKT细胞的用量可以在一个较大范围内变动，本领域技术人员可以根据一些已知的因素，诸如病人体重、年龄、给药途径等很容易地加以确定。
与其它免疫抑制剂相比，本发明药物组合物的优点是具有有效、应用次数少，副作用小的特点，从而减少了长期用药的副作用，长期应用不会引起青光眼、白内障等更加严重的后果，不会引起的肝肾损伤、感染以及肿瘤等副作用；另外NKT细胞存在于多种器官和组织中，如可在肝脏、脾脏、外周血中检测到，可便于分离获得，并且也可从脐带血和血液中诱导培养出NKT细胞，为临床治疗高危角膜移植提供了新的方法。
图1、体外培养3周后的大鼠脾脏淋巴细胞(浓度1×106/ml)。
图2、流式细胞仪分选NKT细胞亚群的结果。图2A淋巴细胞群(浓度1×106/ml)；图2BNKT细胞群(浓度5×105/ml)。
图3、术后第10天角膜植片外眼像。图3A对照组角膜植片混浊，发生免疫排斥反应图；3B试验组角膜植片清亮，没有发生免疫排斥反应。
图4、术后第10天角膜植片组织病理学检查(×200)的结果。图4A对照组角膜植片水肿增厚，大量免疫细胞浸润；图4B试验组角膜植片轻水肿，少量炎性细胞浸润。
具体实施例方式
实施例1NKT细胞的制备在无菌条件下，将2只Lewis纯系大鼠(雌性，8～10周龄，体重160～200克，购自中国医学科学院动物研究所)的脾脏取出，置于含有10ml RPMI-1640培养基(购自美国Gibco公司)的无菌培养皿中，用无菌玻璃棒研磨，使脾脏破裂，并用250目无菌不锈钢网(购自河北钻石金属网业有限公司)过滤，使淋巴细胞通过并形成细胞悬液。将该悬液通过25号的细注射器针头形成单细胞悬液。按照每只脾脏加入2ml 8.7g/L NH4Cl的方法，分别加入经高压灭菌的红细胞裂解液(139.6mmol/L NH4Cl、16.96mmol/L Tris，用1mol/L HCl调pH至7.2)裂解红细胞。室温下作用5分钟后，加入经高压灭菌的GNK缓冲液(8g/L NaCl、0.4g/L KCl、1.77g/L Na2HPO4.2H2O、0.6g/LNaH2PO4.H2O、0.2g/L葡萄糖、0.01g/L酚红)终止红细胞裂解。1500转/分钟，离心5分钟后，去除上清液，用RPMI-1640培养液将细胞反复洗2次，然后将脾脏淋巴细胞接种于96孔培养板(每孔加入100μL浓度为1×105/mL的大鼠脾脏淋巴细胞)，于RPMI-1640培养液中培养，每孔加入10μL IL-7(50ng/mL)和10μL IL-15(50ng/mL)(美国RnD公司)后在37℃细胞培养箱中培养，刺激其增殖活化。3周后，获得1×106/mL浓度的淋巴细胞(图1)。在培养液中加入抗大鼠NK单克隆荧光抗体(R-PE标记的抗大鼠CD161抗体)和抗大鼠TCRα单克隆抗体(FITC标记的抗大鼠TCR-α抗体)(上述两种抗体均购自美国RnD公司)，4℃孵育30分钟后，用磷酸盐缓冲液—牛血清白蛋白溶液(北京中山生物试剂公司)洗涤2次，去除多余抗体，使用FACSVantage流式细胞仪(Becton Dickinson)分选出TCR-α+/CD161+双阳性细胞，即所要的NKT细胞。经过流式细胞仪分选后，获得浓度为5×105/mL的TCR-α+/CD161+双阳性NKT细胞(图2A，B)实施例2用NKT细胞治疗大鼠角膜移植排斥反应(1)建立大鼠正位穿透性角膜移植的模型参照Williams KA，Coster DJ.Penetrating corneatransplantation in the inbred rata new model.Invest ophthalmolVis Sci，1985；26(1)23-30，制备大鼠正位穿透性角膜移植模型8只Fisher344纯系大鼠作为供体，16只Lewis纯系大鼠作为受体。供体和受体均为雌性，8～10周龄，160～200克。所有实验动物均购自中国医学科学院动物研究所(中国北京)。所有实验动物的处置遵照ARVO声明中有关眼科和视觉科学研究中动物使用的规定。
受体术眼术前15分钟以1％阿托品滴眼液和复方托品酰胺滴眼液充分散瞳，每只大鼠肌肉注射30mg盐酸氯胺酮和1mg地西泮进行麻醉。手术在显微镜下进行，常规无菌操作。首先以3.0mm环钻在供体角膜中央划痕，用宝石前房穿刺刀切穿角膜全层后，用角膜剪沿划痕剪下供体角膜植片，置于Optisol液(购自北京同仁眼库)中备用。于受体右眼行穿透性角膜移植，用直径2.5mm的环钻钻取中央区角膜，方法同前，将植片置于植床，以10-0尼龙线间断缝合8针，线结暴露不埋藏。前房内注入小气泡，恢复前房。术毕散瞳，结膜下注射硫酸妥布霉素2000U，结膜囊内涂红霉素眼膏后睑缘缝合。24小时后剪开眼睑缝线用药。手术后出现并发症者(如前房出血，感染，虹膜前粘连，或前房消失)，不计入统计之列。所有动物术后均每日用0.25％氯霉素及复方托品酰胺滴眼液点眼，2次/日，共一周。角膜植片缝线在整个观察期内保留，不去除。
(2)分组与治疗受体大鼠被随机分为治疗组和对照组，每组8只大鼠。治疗组每只大鼠在角膜移植手术结束时结膜下注射0.1ml浓度为5×105/ml NKT细胞，对照组用同样的方法结膜下注射0.1ml生理盐水。
(3)角膜植片排斥反应的观察术后每日在裂隙灯显微镜下观察角膜植片情况直到排斥反应发生，之后隔日观察。根据植片的混浊情况对植片进行评分，评分标准如下(参照Holland EJ，Chan CC，Wetzig RP，et al.Clinical andimmuno-histologic studies of corneal rejection in the ratpenetrating keratoplasty model.Cornea，1991，10(5)374-380.)0植片清亮，无混浊；
1植片轻度浅层非基质层混浊，虹膜纹理清晰可见；2植片轻度深基质层混浊，虹膜纹理模糊可见；3植片中度基质层混浊，虹膜纹理看不清；4植片重度基质混浊，只可见瞳孔；5植片完全混浊，前房看不入；评分在2分或以上者被判定为发生了免疫排斥反应。
(4)角膜植片组织病理学染色检查角膜移植后第10天，每组处死3只大鼠，取其眼球，固定在10％的福尔马林溶液中，石蜡包埋后切片，每张切片5μm厚。染色时将石蜡切片在二甲苯中脱蜡5-10分钟后换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。之后依次放入无水乙醇5分钟，90％乙醇2分钟，70％乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。然后将切片放入苏木素染色液(北京中山生物试剂公司)中作用5-10分钟后，浸入自来水中冲洗去多余的染色液，约10分钟。用蒸馏水再洗涤5秒钟后，放入95％乙醇中5秒，之后放入伊红染色液(北京中山生物试剂公司)中染色30秒后，用95％乙醇脱水2分钟，换用新鲜的95％乙醇再脱水2分钟，二甲苯透明5分钟，换用新鲜的二甲苯，再透明5分钟。用中性树胶封片后在显微镜下观察。
(5)结果见表1不同组别之间角膜植片的存活时间采用单因素方差分析进行比较。
表1.植片存活时间的比较
接受供体角膜植片的所有受体均符合观察条件。除了每组3只大鼠用于取材外，其余每组5只大鼠均完成了整个观察。对照组角膜植片平均存活时间为8.00±1.58天，而NKT细胞治疗组植片平均存活时间为26.00±1.34天，远远高于对照组(表1)。
角膜移植术后第10天，对照组所有植片均发生免疫排斥反应，表现为植片重度混浊水肿，新生血管长入角膜植片。而在NKT细胞治疗组，所有植片均未发生排斥反应，植片清亮，虹膜新生血管清晰可见(图3A、B)。
组织病理学检查也证明对照组所有植片均发生排斥反应，角膜植片明显水肿，大量炎性细胞浸润，新生血管长入；而在NKT细胞治疗组，所有角膜植片均未发生排斥反应，仅仅前部基质轻度水肿，可见少量炎性细胞，未见新生血管长入(图4A、B)。
由上述结果可知NKT细胞结膜下注射，明显延长了大鼠角膜植片的存活时间，可治疗高危角膜移植免疫排斥反应。
通过上述具体的实施例，更容易理解本发明。上述实施例只是举例描述，而不用来限制本发明的范围。
权利要求
1.自然杀伤性T细胞在制备治疗哺乳动物器官移植免疫排斥反应药物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中所述的器官移植是角膜移植。
3.根据权利要求2的用途，其中所述的角膜移植是高危角膜移植。
4.根据权利要求1-3中任何一项的用途，其中所述的哺乳动物是人。
全文摘要
本发明公开了自然杀伤性T(nature killer T cell，NKT)细胞在制备治疗哺乳动物器官移植免疫排斥反应药物中的用途，其中器官移植包括角膜移植、心脏移植、肾移植、胰岛移植、皮肤移植等，优选地是角膜移植，更优选地是高危角膜移植；其中该药物可用于哺乳动物，其中哺乳动物选自人、猴、狗、猫、大鼠、小鼠等，更优选地哺乳动物是人。与其它免疫抑制剂相比，本发明的药物具有应用次数少，局部使用副作用小、疗效确切等特点，从而减少了长期应用免疫抑制剂如糖皮质激素引起青光眼、白内障、肝肾损伤、感染以及肿瘤等副作用，而且该药物容易获得，使用方便，为临床治疗高危角膜移植提供了新的方法。
文档编号A61P37/06GK101028285SQ20071000102
公开日2007年9月5日 申请日期2007年1月19日 优先权日2007年1月19日
发明者潘志强, 接英 申请人:首都医科大学附属北京同仁医院, 北京市眼科研究所