专利名称：一种抗肿瘤免疫活性细胞－dcik细胞、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种抗肿瘤免疫活性细胞——DCIK细胞、其制备方法及应用。
在肿瘤治疗方法中，免疫治疗已成为手术治疗，化疗和放疗之外最重要的、最有希望的治疗手段。在过去的20年里，肿瘤特异性主动免疫治疗和过继免疫治疗两个方面研究都有很大的发展。
在肿瘤过继免疫治疗中，先后出现了五种引人注目的免疫效应细胞。这就是淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)(Rosenberg SA，et al.N.Engl.J.Med.3131485-1492，1985)，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL细胞)(Itoh K，et al.J Exp.Med.1681419-1441，1988)，抗白细胞分化抗原-3单克隆抗体(CD3单抗)和白细胞介素-2(IL-2)诱导的杀伤细胞(AK-T细胞)(Uberti JP，et al.Clin.Immunol.Immunother，70234-240，1994)，细胞毒T淋巴细胞(CTL)(Aruga A，et al.Int.J.Cancer，4919-24，1991)和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)(Schmidt-wolf IGH，et al.J.Exp.Med.174139-149，1991)。多年的临床前和临床研究发现曾被认为具有巨大免疫治疗价值的LAK细胞因其增殖性能不理想和细胞毒活性较低且维持时间较短而渐被冷落。CTL和TIL，特别是CTL，从理论上是最被看好的免疫效应细胞，因目前尚无有效扩增手段及其他一些限制因素而未被临床广泛应用。于是人们逐渐把希望移向了后二种效应细胞——AK-T细胞和CIK细胞。AK-T细胞和CIK细胞都是用抗CD3单抗为刺激因子激发T淋巴细胞增殖，具有相同的增殖活性。CIK细胞还有赖于其它细胞因子的参与，因此，CIK细胞具有比AK-T细胞更强的细胞毒活性。但是，与AK-T细胞和LAK细胞一样，CIK细胞也不具有特异性识别和杀伤肿瘤细胞的特性。
在众多肿瘤主动特异性免疫治疗方法中，树突状细胞(DC)作为新一代肿瘤疫苗的研究和应用成为近年来主动免疫治疗研究中的热点。在机体免疫反应中，DC是最主要的抗原提呈细胞，具有捕获、加工处理抗原和向T淋巴细胞提呈抗原分子、表达共刺激分子、释放细胞因子和白细胞介素等特性。因此，DC在肿瘤细胞免疫应答中起主要免疫调节作用，是肿瘤主动特异性免疫最重要的免疫辅佐细胞。
当DC与CIK细胞共培养时，彼此能互相作用而诱导出比CIK细胞有更强增殖活性、更高肿瘤细胞杀伤活性的细胞群(Marten A et al.J.Immunother 24(6)502-510，2001)。但是这种细胞对恶性细胞的攻击与CIK细胞一样缺乏抗原特异性。Peter M等人曾发现，当DC细胞经用肿瘤相关抗原冲击后与肿瘤侵润淋巴细胞(TIL)共培养时，诱导出的效应细胞具有明显的对恶性细胞的特异性攻击的能力(Peter M.，et al.Clin.Cancer Res.5445-454，1999)。但是这种免疫效应细胞扩增能力有限，且TIL来源困难。
为达到这一目的，本发明在Marten和Peter等人研究的基础上，分别用细胞因子诱导DC和CIK细胞，然后用肿瘤抗原冲击DC，将经抗原冲击过的DC与CIK细胞按一定比例混合进行共培养，得到一种新的免疫效应细胞群，我们将这种用经肿瘤抗原冲击过的DC与同源CIK细胞共培养所产生的免疫效应细胞群定名为DCIK细胞。
DCIK细胞的具体制备方法如下一、外周血单个核细胞(PBMC)的制备取肿瘤病人抗凝外周血20～50ml用生理盐水对倍稀释后，用比重为1.077的淋巴细胞分离液分离PBMC。分离所用离心机之转头为水平转头，离心速度为2000rpm，离心20～25分钟。然后用Hanks平衡液洗涤PBMC 2次，再进行显微镜下细胞计数，最后用淋巴细胞培养液AIM-V调节细胞密度成3～5×106/ml的细胞悬液。
二、外周血淋巴细胞(PBL)和粘附细胞的分离将前述细胞悬液移入6孔板，每孔3-5ml，置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱温育2小时，然后用移液管轻轻冲吸细胞，将非粘附PBL悬液收集在50ml离心管中，6孔板中留下的粘附细胞作诱导DC用。
三、CIK细胞的诱导和扩增在上述PBL悬液中添加重组人γ-干扰素(IFN-γ)终浓度为1000u/ml，然后移入表面积为25cm2的培养瓶中，每瓶装量10ml，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中温育24小时。然后采用固相CD3单抗刺激的方法，将全部细胞悬液移入CD3单抗包被过的25cm2培养瓶中，再添加重组人白细胞介素-1(IL-1)和重组人白细胞介素-2(IL-2)，终浓度分别为100μg/ml和500μg/ml。或采用液相刺激法，即直接添加CD3单抗，IL-1和IL-2，浓度分别为50ng/ml，100μg/ml和500μg/ml。继续培养48～72小时后显微镜下细胞计数，然后用CIK细胞培养液(AIM-V，含IL-1和IL-2，浓度分别为100u/ml和500u/ml)调节细胞密度为3×105/ml，分配到25cm2培养瓶中，每瓶10ml，进行扩大培养。此后，每隔48或72小时按上述相同条件扩大培养一次。培养至第8天时收集CIK细胞待用。
上述步骤中CD3单抗包被方法在AIM-V中加入CD3单抗，使成为CD3单抗浓度为5-10μg/ml的包被液。在25cm2培养瓶中加入5ml包被液，4℃过夜或者37℃温育2小时后，弃去全部包被液体即可。
四、DC诱导和扩增在前述留有粘附细胞的6孔板中每孔加入DC培养液3ml。DC培养液为重组人粒细胞巨噬细胞克隆刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)，浓度分别为800u/ml和500u/ml。置6孔板于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养5天，然后在各孔添加自体瘤细胞裂解液，使裂解液蛋白终浓度为10-50ug/ml，继续培养2～3天后，用移液管冲吸和收集非粘附和半粘附性DC待用。
上述自体瘤细胞裂解液的制备方法手术切除的肿瘤组织用Hank’s平衡液洗去血液，剪除坏死组织，结缔组织和脂肪组织，留下新鲜瘤组织，剪碎后用匀浆器研磨，再反复冻融5次，加适量Hank’s平衡液，3000rpm离心10分钟，弃去沉淀，上清取样测蛋白浓度后于-20℃贮存。贮存裂解液蛋白浓度不应低于1mg/ml，低于此浓度需作浓缩处理。
五、DC与CIK细胞共培养制备DCIK细胞培养7～8天的DC和CIK细胞，分别计数，离心弃上清后，分别用CIK培养液调节细胞密度为6×105/ml和2×105/ml，等体积混合后移入25cm2培养瓶中，每瓶10ml。此时总细胞密度为4×105/ml，CIK∶DC＝3∶1。置37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养，每隔48～72小时按以上细胞密度分瓶扩大培养一次。
以上制备过程中所用吸管和离心管为聚丙烯(polypropylene)材料，6孔板和培养瓶为聚苯乙烯(polystyrene)材料。此外，若改用其他规格培养器皿，应根据培养面积大小调整上述细胞悬液接种量。
上述共培养得到的DCIK细胞与LAK、CIK细胞一样为一非均质细胞群，其主要生物学特性有(1)细胞组成DCIK细胞中T淋巴细胞占98％以上和少量DC。T淋巴细胞中各亚群所占比例具有个体差异和因体外培养时间长短而有一定变化范围。一般为CD3+CD4+T细胞20-40％，CD3+CD8+T细胞50-80％，CD3+CD56T细胞(NKT细胞)10-50％，以及很可能存在的CTL(CD8+)；(2)增殖活性高DCIK细胞增殖活性比CIK细胞强大。体外扩增3-4周后，DCIK细胞比同源CIK细胞和LAK细胞分别大2-4倍和20-40倍；(3)释放细胞因子量大DCIK细胞释放IFN-γ的量是同源CIK细胞的2-5倍；(4)细胞毒性高与同源CIK细胞比较，DCIK细胞体外对特异性靶细胞的杀伤作用高出10-20％，表现对恶性细胞的特异性杀伤。人癌动物模型治疗实验表明，DCIK组动物的平均存活期是CIK组动物的1.3倍。
DCIK细胞主要用于自体瘤治疗，术后即时施治能有效防转移防复发，也可作化学疗法的辅助治疗，此外，DCIK细胞也可用于某些传染性疾病的免疫治疗。
上述步骤中CD3单抗包被方法在AIM-V中加入CD3单抗，使成为CD3单抗浓度为5-10μg/ml的包被液。在25cm2培养瓶中加入5ml包被液，4℃过夜或者37℃温育2小时后，弃去全部包被液体即可。4.DC诱导和扩增在前述留有粘附细胞的6孔板中加入DC培养液(AIM-V中含GM-CSF和IL-4，浓度分别为800u/ml和500u/ml)，每孔3ml，37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养5天，然后在各孔添加自体瘤细胞裂解液，使裂解液蛋白终浓度为10-50ug/ml，继续培养2～3天后，用移液管冲吸和收集非粘附和半粘附性DC待用。
上述自体瘤细胞裂解液的制备方法手术切除的肿瘤组织用Hank’s平衡液洗去血液，剪除坏死组织，结缔组织和脂肪组织，留下瘤组织，剪碎后用匀浆器研碎，再反复冻融5次，加适量Hank’s平衡液，3000rpm离心10分钟，弃去沉淀，上清取样测蛋白浓度后于-20℃贮存。贮存裂解液蛋白浓度不低于1mg/ml，否则需作浓缩处理。5.DC与CIK细胞共培养制备DCIK细胞
培养7～8天的DC和CIK细胞，分别计数，离心弃上清后，分别用CIK培养液调节细胞密度为6×105/ml和2×105/ml，等体积混合后移入25cm2培养瓶中，每瓶10ml。此时总细胞密度为4×105/ml，CIK∶DC＝3∶1。置37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养，每隔48～72小时按以上细胞密度分瓶扩大培养一次。
权利要求
1.一种DCIK细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤一、PBMC的制备取肿瘤病人抗凝外周血20～50ml，生理沿水对倍稀释后，用比重为1.077的淋巴细胞分离液以分离PBMC，分离所用离心机之转头为水平转头，离心速度为2000rpm，离心20～25分钟，然后用Hanks平衡液洗涤PBMC 2次，再进行显微镜下细胞计数，最后用淋巴细胞培养液AIM-V调节细胞密度成3～5×106/ml的细胞悬液；二、PBL和粘附细胞的分离将细胞悬液移入6孔板，置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱温育2小时，然后用移液管轻轻冲吸细胞，将非粘附PBL悬液收集在离心管中，6孔板中留下的粘附细胞作诱导DC用；三、CIK细胞的诱导和扩增在上述PBL悬液中添加重组人IFN-γ终浓度为1000u/ml，然后移入培养瓶中，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中温育24小时，之后，每瓶添加鼠抗人CD3单克隆抗体，IL-1和IL-2，终浓度分别为50ng/ml，100u/ml和500u/ml；或者采用固相CD3单抗刺激的方法，即将全部细胞悬液移入CD3单抗包被过的培养瓶中，再添加IL-1和IL-2，终浓度分别为100u/ml和500ug/ml。继续培养48～72小时后显微镜下细胞计数，然后用CIK细胞培养液调节细胞密度为3×105/ml，分配到25cm2培养瓶中，进行扩大培养，此后，每隔48或72小时按上述相同条件扩大培养一次，培养至第8天时收集CIK细胞待用；四、DC诱导和扩增在前述留有粘附细胞的6孔板中加入DC培养液，37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养5天，然后在各孔添加自体瘤细胞裂解液，使裂解液蛋白终浓度为10-50ug/ml，继续培养2～3天后，用移液管冲吸和收集非粘附和半粘附性DC细胞待用；五、DC与CIK细胞共培养制备DCIK细胞培养7～8天的DC和CIK细胞，分别计数，离心弃上清后，分别用CIK培养液调节细胞密度为6×105/ml和2×105/ml，等体积混合后移入培养瓶中，置37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养，每隔48～72小时按4×105/ml的起始细胞密度分瓶扩大培养一次。
2.如权利要求1所述的一种DCIK细胞的制备方法，其特征在于所述的步骤三CIK细胞的诱导与扩增，采用固相CD3单克隆抗体刺激的步骤，包括在AIM-V中加入CD3单抗，使成为CD3单抗浓度为5-10μg/ml的包被液，在培养瓶中加入包被液，4℃过夜或者37℃温育2小时后，弃去全部包被液体，然后移入经IFN-γ处理过的PBL悬液接受CD3单抗刺激。
3.如权利要求1所述的一种DCIK细胞的制备方法，其特征在于所述的步骤四DC的诱导与扩增，还包括制备自体瘤细胞裂解液的步骤，包括将手术切除的肿瘤组织用Hank’s平衡液洗去血液，剪除坏死组织，结缔组织和脂肪组织，留下瘤组织，剪碎后用匀浆器研磨，再反复冻融5次，加适量Hank’s平衡液，3000rpm离心10分钟，收集上清并取样测蛋白浓度后于-20℃贮存，贮存肿瘤细胞裂解液之蛋白浓度不低于1mg/ml。
4.一种权利要求1的方法制备得到的DCIK细胞。
5.如权利要求4所述的DCIK细胞在自体瘤治疗、术后防转移防复发、化学疗法的辅助治疗以及某些传染性疾病的免疫治疗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗肿瘤免疫活性细胞－DCIK细胞、其制备方法及应用，主要是利用细胞因子诱导DC和CIK细胞，然后用肿瘤抗原冲击DC细胞，将经抗原冲击过的DC与CIK细胞按一定比例混合进行共培养，得到一种新的免疫效应细胞群，即DCIK细胞。本发明的DCIK细胞与CIK细胞比较，增殖活性和细胞毒活性更强，且表现对恶性细胞的特异性杀伤。上述DCIK细胞主要用于自体瘤治疗，术后即时施治能有效防转移防复发，也可作化学疗法的辅助治疗，此外，DCIK细胞也可用于某些传染性疾病的免疫治疗。
文档编号A61K45/00GK1431298SQ03115299
公开日2003年7月23日 申请日期2003年1月30日 优先权日2003年1月30日
发明者徐永华, 王恩忠 申请人:中国科学院上海生命科学研究院