的一个泳道切下来，用超级灵敏度蛋白质电泳快速染液进行染色， 其余凝胶进行NBT染色。
[0141]NBT染色
[0142] 将凝胶浸泡在NBT染色溶液1 (0. 245MmNBT溶液）中，避光放置20min。然后将 凝胶依次转至NBT染色溶液2 (36mMPBS，28mMTEMED，0. 028mM核黄素，pH7. 8)和NBT染色 溶液3(50mMPBS，0.ImM邸TA，pH7.8)中，分别在日光下浸泡20min，期间需多次振摇混匀。 最后将凝胶转至蒸馈水中清洗后拍照保存结果。
[0143] 纯酶液中金属元素测定
[0144] 利用ICPE-9000等离子发射光谱仪测定纯酶液中铁、儘、铜、锋、铭、儒、铅、侣等金 属元素。检验依据为《生活饮用水标准检验方法金属指标》（GB/T5750. 6-2006)。利用铁、 儘、铜、锋、铭、儒、铅、侣等标准使用液配制标准系列，调节仪器至最佳工作状态，测定标准 系列，绘制标准曲线，计算回归方程。然后将纯酶液导入仪器，测定各金属元素。
[0145] 溫度对酶液活性的影响
[0146] 将某批纯酶液分别在60°C加热处理15min、30min、比、化、3h;在65 °C加热处 理15min、30min、lh。置冰浴冷却后于14000Xg离屯、lOmin。取离屯、后的酶液上清，用 Broa壯ord法测定蛋白浓度，用微量连苯Ξ酪自氧化法测定比活性，并与未处理的酶液活性 进行比较。
[0147] 抑环境对酶液活性的影响
[0148] 将某批纯酶液分别用抑4. 0、pH4. 5、P册.0、抑5. 5、P册.0、P册.5、抑7. 0、抑7. 5、 P册.0、p册.5、pH9. 0、p册.5和抑10. 0的缓冲溶液做1 : 5稀释后，置25°C解育至少20min。 用微量连苯Ξ酪自氧化法测定酶处理液的活性。
[0149] 祀T30a-sod表达质粒的构建与表达
[0150]sod基因的克隆
[0151] 如图2所示，用特异性引物对SPS0DF/SPS0DR从所提取纯顶螺旋藻DNA中成功扩 增出一特异性条带，此条带位于750bp与500bp之间，其大小与预期扩增基因片段大小一 致。
[0152] 纯化的PCR产物与pGEM-TEasyVector连接所构建的重组质粒经PCR扩增和EcoR I酶切鉴定，均证实有约600bp的片段成功插入克隆载体中。对该插入片段进行测序并对所 获序列进行Blast分析，结果表明所克隆基因序列与GenBank中纯顶螺旋藻sod基因序列 (登录号：AY282414)完全一致。
[0153] 祀T30a-sod重组质粒的构建
[0154]如图3、图4所示，利用NdeI和化〇1分别双酶切重组质粒pGEM-T-sod和 pET30a-apcα，获得长度分别约为614bp的插入片段和5076bp的祀T30a线性化载体。将 此插入片段和线性化载体相连接并转化感受态细胞JM109。对所提取质粒测序表明插入片 段和载体成功连接，说明祀T30a-sod表达质粒成功构建。如图5所示为质粒祀T30a-sod的开放阅读框及其编码的氨基酸序列。
[0155] 重组SOD的表达
[0156] 如图6所示，转入重组表达质粒祀T30a-sod的大肠杆菌化21 (DE3)经终浓度为 0. 40mM的IPTG化诱导，成功表达了分子量约为22kDa的重组蛋白。
[0157] 重组蛋白的高密度发酵结果
[0158] 发酵开始前化细菌生长相对缓慢，发酵至第化时，0D600为4. 31，菌湿重为13g/ L。化后细菌开始迅速生长，至第化时，0D600达到20.45,菌湿重为22g/L。化后，细菌生 长变慢，开始补料。此后，细菌又恢复生长，并进入了平缓生长期。发酵至第1化时，0D600 达到33. 2,菌湿重达到了 38g/L。此后化内，细菌生长变慢，0D600和菌湿重均有所下降， 第2化时结束发酵。如图7所示，发酵过程中细菌的生长曲线。如图8所示，SDS-PAGE分 析显示，IPTG开始诱导时，细菌裂解液上清中无蛋白表达，经IPTG诱导后成功表达了分子 量为22kDa的重组蛋白。
[0159] 重组SOD的纯化
[0160] 如图9所示，重组菌裂解液经特异性结合树脂Ni-NTA Agarose-轮纯化后，获得 了成分单一的目的蛋白S0D，且纯化后的粗蛋白洗涂液中目的蛋白量已很少。
[0161] 重组SOD的浓度和活性测定
[0162] 纯化的重组SOD经化oa壯ord测定，其蛋白浓度为为3mg/ml。微量联苯Ξ酪自氧 化法测得其酶活性为l〇517U/ml，比活性为350抓/mg。
[0163] 重组SOD非变性凝胶电泳与NBT染色结果
[0164] 如图10所示，非变性凝胶电泳分析表明重组SOD的天然分子量为38kDa，提示重 组SOD可能W二聚体的形式存在。将SOD与PBS、&〇2溶液、氯仿-乙醇混合液等分别解育 后再进行非变性凝胶电泳，并对凝胶进行NBT染色。结果显示&〇2溶液可部分抑制SOD的 活性，氯仿-乙醇混合液可完全抑制SOD的活性，而对照PBS不能抑制SOD的活性。实验结 果表明本研究所制备的SOD为化-SOD。
[0165] 纯酶液中金属元素含量
[0166] 利用ICPE-9000等离子发射光谱仪测得纯酶液（蛋白浓度为0. 95mg/ml)中金属 元素所含量见表1。通过计算，得知每个纯酶二聚体约馨合1. 35个铁原子。
[0167] 表1.纯酶液中金属元素含量 [016引
[0169] 重组SOD的热稳定性
[0170] 如图11所示，某批纯化的纯酶液经60°C加热，随着加热时间的延长，SOD的比活性 在缓慢降低。经60°C热处理ISOmin，SOD的比活性从3380U/mg降低到2343U/mg，其活性降 低为原来的69. 3%。如图12所示，重组SOD在65°C条件下活性降低较快，经65°C加热处理 60min，其活性降低为原来的42. 7%。
[0171] 重组SOD的酸碱稳定性
[0172] 如图13所示，将纯化后的SOD用不同抑值的缓冲溶液处理后测定酶的活性，结果 显示SOD在抑4. 0至抑9. 5范围内比较稳定，在此范围内活性变化不大。当抑值达到10 时，酶的活性稍有所下降。
【主权项】
1. 一种重组螺旋藻超氧化物歧化酶，其特征在于所述的重组螺旋藻超氧化物歧化酶基 因序列的核苷酸序列和相应的氨基酸序列为：2. -种重组螺旋藻超氧化物歧化酶制备工艺，其特征在于：所述的制备工艺步骤如 下： 一、 螺旋藻基因组DNA的提取 (1) 用双蒸水将新鲜钝顶螺旋藻5000g离心5min共洗3次； (2) 在预先经冷冻处理的研钵中将280mg新鲜钝顶螺旋藻与少量灭菌的石英砂混合， 充分研磨； (3) 按植物基因组DNA提取试剂盒说明书的步骤进行提取基因组DNA ; (4) 提取的基因组DNA洗脱于50 μ 1洗脱液TE中； (5) 洗脱后的基因组DNA在-20Γ温度下保存备用。 二、 sod基因片段的扩增 (1) 根据GenBank中登录的AY282414螺旋藻sod基因序列设计扩增引物：上游引物 SPS0DF : 5' -ACATATGGCTTTTGAACT TCCCAG-3';下游引物 SPS0DR : 5' -GCTCGAGGCTGGCAGA CGCGAGA-3 ^，引物对预期扩增片段长614bp ; (2) PCR扩增sod基因，以所提取螺旋藻基因组DNA为模板，利用上述引物对扩增sod基 因，PCR反应条件为：94°C预变性3min，94°C变性45s，55°C退火45s，72°C延伸45s，共30个 循环，然后，72°C再延伸6min ; (3) 取5 μ 1 PCR产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳分析。 三、 sod基因片段的克隆 (1)将45 μ 1 PCR扩增产物经1. 5 %琼脂糖凝胶电泳分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂 盒切胶回收目的基因片段，回收产物用40 μ 1洗脱缓冲液EB洗脱，具体操作按琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒说明书进行； (2) 将3 μ 1纯化的PCR产物和1 μ 1克隆载体pGEM-T Easy Vector在4°C连接过夜； (3) 将5 μ 1连接产物热激转化100 μ 1感受态大肠杆菌DH5 α并涂布于含有50 μ g/ml 氨苄青霉素的LB琼脂平板上，置37 °C过夜培养； (4) 次日，用无菌牙签挑取白色菌落接种于含Amp的LB液体培养基中，37 °C摇床培养过 夜； (5) 用普通质粒小提试剂盒提取质粒。以SPS0DF和SPS0DR为引物对提取质粒的插入 片段进行扩增鉴定，同时用EcoR I对所提取质粒进行酶切鉴定； (6) 将经PCR、酶切鉴定均正确的质粒进行测序； (7) 测序结果用NCBI中的Blast软件分析。 四、 sod基因原核表达载体的构建 (1) 将测序正确的重组质粒pGEM-T-sod和重组质粒pET30a_a pea为本实验室构建 的钝顶螺旋藻别藻蓝蛋白a亚基基因