专利名称：氨基-羧基端互换的黄色荧光蛋白的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及氨基-羧基端互换的黄色荧光蛋白的新用途。
背景技术：
活性氧是一类化学性质非常活泼的含氧自由基或非自由基，它是一把双刃剑，其“好坏”取决于活性氧产生的时间、空间及浓度。在生理和病理条件下活性氧都起着至关重要的作用。在生理条件下，活性氧参与多种生理功能，如前列腺素、凝血酶原等的合成，核苷酸的还原，体内药物、毒物解毒过程，吞噬细胞杀菌过程，另外，活性氧作为信号分子参与多条信号通路，如诱导炎症和免疫反应有关的基因表达，活性氧还作为信号分子在细胞、组织和器官的发生、生长过程中发挥重要作用。在病理条件下，在体内外的各种刺激作用下，活性氧可在体内大量产生、聚积，超过生理剂量的活性氧可通过对脂质进行过氧化反应，破坏细胞膜的通透性，使细胞损伤及脂酶失活，并可攻击蛋白，使蛋白和蛋白酶变性、失活，还可通过碱基修饰损伤DNA，这些直接作用都可以引起细胞损伤，甚至引起细胞凋亡或坏死；但超过生理剂量而又不足以引起细胞坏死的活性氧更有可能作为信号分子启动各种损伤反应。
活性氧主要产生于线粒体呼吸链，是电子在呼吸链传递过程中因电子漏而产生的，其中超氧阴离子(superoxide anion radical，O2·-)是呼吸链的直接产物，随后超氧阴离子再被转化为过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)、羟自由基(hydroxylradical，·OH)等其他活性氧。
目前，在活细胞内检测活性氧的指示剂主要是对活性氧敏感的荧光染料，其中，被广泛使用的是二氯荧光素双醋酸盐(2′，7′dichlorodihydrofluorescindiacetate，H2DCFDA)，该荧光染料能够比较灵敏的测定细胞浆中活性氧的水平，但存在很多缺点，如在激光扫描下，它会和光子发生相互作用而产生活性氧；缺乏特异性，能够与多种氧化剂反应；由于该指示剂是有机化合物，不能被定位到特定的细胞区域，只能测定细胞浆中的活性氧水平。因此迫切需要能定位到特定细胞器尤其是线粒体中的特异于活性氧的指示剂。以荧光蛋白为基础的活性氧指示剂既可以利用分子生物学的手段对其改造，使其定位表达于特定的细胞器，又能够特异性的测定不同种类的活性氧，而且能够在整体水平测定活性氧的水平，从而能够测定不同的生理病理条件下不同种类活性氧的时空特性。
发明内容
本发明的目的是提供一种氨基-羧基端互换的黄色荧光蛋白的新用途。本发明的氨基-羧基端互换的黄色荧光蛋白可作为活性氧荧光蛋白指示剂，该活性氧荧光蛋白指示剂能在分子、细胞及整体水平实时测定不同生理病理状态下超氧阴离子的时空特性。
本发明的活性氧荧光蛋白指示剂包括两种，一是能检测细胞浆中O2·-的活性氧荧光蛋白指示剂，命名为cpYFP，是氨基-羧基端互换的黄色荧光蛋白，其氨基酸序列为序列表中的序列1；二是能检测线粒体中O2·-的活性氧荧光蛋白指示剂，命名为mt-cpYFP，是在cpYFP的N端加了一段线粒体定位序列获得的黄色荧光蛋白，其氨基酸序列为序列表中的序列2。
本发明的活性氧荧光蛋白指示剂可通过将cpYFP或mt-cpYFP蛋白的编码基因构建到真核表达质粒、原核表达质粒和腺病毒表达体系中，再将构建的重组质粒或腺病毒导入宿主细胞中而表达cpYFP或mt-cpYFP蛋白，cpYFP或mt-cpYFP蛋白能够在分子及细胞水平实时检测O2·-的特性。
cpYFP蛋白的编码基因具体可为序列表中的序列3；mt-cpYFP蛋白的编码基因具体可为序列表中的序列4。
本发明的另一个目的是提供一种能监测超氧阴离子变化的动物模型的构建方法。
本发明所提供的能监测超氧阴离子变化的动物模型的构建方法，是将cpYFP或mt-cpYFP基因导入动物受精卵母细胞中，获得能监测超氧阴离子变化的转基因动物模型。
其中，所述动物具体可为ICR小鼠。
利用转基因动物制备技术，将cpYFP或mt-cpYFP转入小鼠中，可制备成全身性表达或组织特异性表达(心脏特异性表达、神经特异性表达)所述cpYFP或mt-cpYFP蛋白的转基因小鼠，从而能在整体水平实时测定不同的生理病理条件下O2·-的变化。全身性表达cpYFP或mt-cpYFP蛋白的转基因小鼠模型是具体可为将所述的cpYFP或mt-cpYFP基因序列转入ICR小鼠的基因组中，其表达所用的启动子是β-actin启动子；心脏特异性表达cpYFP或mt-cpYFP蛋白的转基因小鼠模型具体可为将所述的cpYFP或mt-cpYFP基因序列转入ICR小鼠的基因组中，其表达所用的启动子是α-MHC启动子；神经特异性表达cpYFP或mt-cpYFP蛋白的转基因小鼠模型是将所述的cpYFP或mt-cpYFP基因序列转入ICR小鼠的基因组中，其表达所用的启动子是En1启动子。
本发明的活性氧荧光蛋白指示剂可在细胞中定位、实时测定超氧阴离子的变化，通过制备活性氧荧光蛋白指示剂的转基因小鼠模型可实时测定不同生理病理条件下不同组织的活性氧变化。
图1SDS-PAGE鉴定从E.coli中分离纯化的cpYFP蛋白 图2为超氧阴离子黄色荧光蛋白指示剂cpYFP的光谱特性 图3为线粒体定位的超氧阴离子黄色荧光蛋白指示剂mt-cpYFP在不同细胞中的表达 图4为单个线粒体中的超氧炫 图5为心肌细胞的超氧炫在缺氧再灌注处理过程中的变化 图6为cpYFP转基因小鼠心脏中超氧阴离子的变化，整体心脏上的超氧炫
具体实施例方式 实施例1、超氧阴离子黄色荧光蛋白指示剂 (1)超氧阴离子黄色荧光蛋白指示剂的制备 以pcDNA3-ratiometric-pericam-mt(Nagai，T.，Sawano，A.，Park，E.S.，andMiyawaki，A.(2001).Circularly permuted green fluorescent proteinsengineered to sense Ca2+.Proc Natl Acad Sci USA 98，3197-3202.)(北京大学)为模板，利用引物P1和P2扩增超氧阴离子黄色荧光蛋白基因(cpYFP)，引物P1和P2的序列如下 P1PstI CTGCAGATGTACAACAGCGAC P2KpnI GGTACCTTAGGTACCGTTGTAC PCR扩增出约750bp的cpYFP片段，cpYFP片段回收后连接到pRSET载体上，构建重组质粒pRSET-cpYFP，进行测序，测序结果表明cpYFP片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示，编码序列表中序列1所示的蛋白。将重组质粒pRSET-cpYFP转化入E.coli.(BL21(DE3)LysS中，获得重组菌BL-cpYFP。
重组菌BL-cpYFP在LB培养基中37℃培养至菌体浓度OD600为0.7，加入0.1mMIPTG，37℃诱导表达6h，用Ni亲和层析柱从菌体裂解液中分离纯化cpYFP蛋白，经SDS-PAGE鉴定，只在约30kD处有一条蛋白条带，为cpYFP蛋白(图1)，图1中1为Marker，2为用Ni亲和层析柱分离纯化的cpYFP蛋白。
(2)超氧阴离子荧光蛋白指示剂的光谱特性 cpYFP蛋白溶解于平衡溶液中配制成终浓度为1μM的蛋白溶液，平衡溶液中含有75mM的HEPES，125mM的KCl和1mM的EDTA(pH＝8.0)。
在连续充氮的惰性环境下(氧分压为零)，1μM cpYFP溶液分别与10mM还原型的二硫苏糖醇(DTT)或1mM的Aldrithiol孵育至少3小时，还原型的DTT能维持cpYFP的还原状态，Aldrithiol能维持cpYFP的氧化状态，去除还原型的DTT后，完全还原态的cpYFP进行如下任一种处理 (a)完全还原态的cpYFP溶液暴露在有氧环境中(图2B中用“d”表示)； (b)完全还原态的cpYFP溶液暴露在有氧环境中，加入次黄嘌呤，使次黄嘌呤的终浓度为2mM，再加入20mU的次黄嘌呤氧化酶(图2B中用“e”表示)； (c)完全还原态的cpYFP溶液暴露在有氧环境中，加入次黄嘌呤，使次黄嘌呤的终浓度为2mM，再加入20mU的次黄嘌呤氧化酶，最后加入超氧化物歧化酶，使其终浓度为600U/ml(图2B中用“f”表示)。
(d)完全还原态的cpYFP溶液在无氧环境下加入H2O2，使H2O2的终浓度为0.1mM(图2C中用“h”表示)； (e)完全还原态的cpYFP溶液在无氧环境下加入H2O2，使H2O2的终浓度为10mM(图2C中用“i”表示)； (f)完全还原态的cpYFP溶液在无氧环境下加入H2O2，使H2O2的终浓度为1mM，再加入FeSO4，使FeSO4的终浓度为0.1mM(图2C中用“j”表示)。
测定上述各个处理条件下cpYFP的发射光谱。激发和发射光谱利用荧光光谱仪(ModelCM1T10I，HORIBA Jobin Yvon，Inc.)进行测定。
光谱特性测定的实验结果表明，cpYFP在完全还原(图2中用“a”表示)和完全氧化状态下(图2中用“b”表示)的激发光和发射光波长分别为488nm和515nm，cpYFP强氧化状态下的荧光强度是还原状态下的5倍(图2A)；cpYFP能选择性地对黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶产生的O2·-发生反应，在有氧条件下黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶产生的O2·-增强了cpYFP的荧光强度(图2B中用“e”所示)；O2分子和过氧化物歧化酶产生的过氧化氢及0.1和10mM的H2O2都不增强cpYFP的荧光强度，而1mM的H2O2和FeSO4产生的·OH降低了cpYFP的荧光强度(图2C)。
(3)超氧阴离子荧光蛋白指示剂mt-cpYFP在线粒体中的定位表达 以pcDNA3-ratiometric-pericam-mt(Nagai，T.，Sawano，A.，Park，E.S.，andMiyawaki，A.(2001).Circularly permuted green fluorescent proteinsengineered to sense Ca2+.Proc Natl Acad Sci USA 98，3197-3202.)(北京大学)为模板，利用引物P1和P2扩增超氧阴离子黄色荧光蛋白基因(cpYFP)，引物P1和P2的序列如下 P1Hind III AAGCTTATGCTGAGCCTGCGC P2EcoR V GATATCTTAGGTACCGTTGTAC PCR扩增出约800bp的mt-cpYFP片段，mt-cpYFP片段回收后连接到pShuttle-CMV载体上，构建重组质粒pShuttle-mt-cpYFP，进行测序，测序结果表明mt-cpYFP片段mt-cpYFP片段的核苷酸序列如序列表中序列4所示。利用stratagene公司的病毒包装试剂盒(#240010)进行腺病毒包装，利用所得的表达mt-cpYFP的腺病毒分别转染新生大鼠心脏成纤维细胞、Hela细胞和成年大鼠心肌细胞，用激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM 510)观察转染后的细胞，激发光和发射光波长分别为488nm和＞505nm。
实验结果表明，mt-cpYFP在新生大鼠心脏成纤维细胞(图3A)、Hela细胞(图3B)和成年大鼠心肌细胞(图3C)中高效、定位表达于线粒体。
实施例2、超氧阴离子荧光蛋白指示剂检测活性氧的变化 (1)超氧阴离子荧光蛋白指示剂实时测定细胞中的活性氧水平 激光共聚焦显微镜实时观测实施例1中转染的成年大鼠心肌细胞、细胞外液中加入超氧化物岐化酶的类似物MnTMPyP的实施例1中转染的成年大鼠心肌细胞和细胞外液中加入超氧阴离子清除剂tiron的实施例1中转染的成年大鼠心肌细胞。
激光共聚焦显微镜实时观测的结果如图4所示，表明单个线粒体会自发的在短时间内(~10s)突然产生大量超氧阴离子，将此现象命名为“超氧炫”(superoxideflash)，并且其发生频率和幅度可被超氧化物岐化酶的类似物MnTMPyP和超氧阴离子清除剂tiron降低。
图4A中上部分为激光共聚焦显微镜所拍摄的表达cpYFP的成年大鼠心肌细胞，下部分为局部放大区，局部放大区域显示按时间展开的单个线粒体的超氧炫，每幅图像间隔2S；图4B为典型的超氧炫的时间和幅度特性；图4C为超氧化物岐化酶的类似物MnTMPyP和超氧阴离子清除剂tiron降低了超氧炫的频率，1代表实施例1中转染的成年大鼠心肌细胞，2代表细胞外液中加入超氧化物岐化酶的类似物MnTMPyP的实施例1中转染的成年大鼠心肌细胞，3代表细胞外液中加入超氧阴离子清除剂tiron的实施例1中转染的成年大鼠心肌细胞；图4D为超氧化物岐化酶的类似物MnTMPyP和超氧阴离子清除剂tiron降低了超氧炫的幅度，1代表实施例1中转染的成年大鼠心肌细胞，2代表细胞外液中加入超氧化物岐化酶的类似物MnTMPyP的实施例1中转染的成年大鼠心肌细胞，3代表细胞外液中加入超氧阴离子清除剂tiron的实施例1中转染的成年大鼠心肌细胞。
对转染的成年大鼠心肌细胞进行缺氧再灌注处理，测定超氧阴离子的变化，实验结果如图5，表明在心肌细胞缺氧-再灌注早期，超氧炫频率出现上调，因此超氧炫可作为多种氧化应激相关疾病的生物标志物。
图5A是心肌细胞的二维图像，方框表示心肌细胞在复氧5分钟时，100秒内记录到的超氧炫的位置。图5B表示3个具有代表性的细胞分别在缺氧6小时和复氧5分钟的情况下，一定时间内记录到的超氧炫的数目的统计结果(一条小竖线表示发生一次超氧炫)，其中左侧的图表示缺氧6小时情况下超氧炫数目的统计结果，右侧的图表示复氧5分钟的情况下超氧炫数目的统计结果。
(2)整体动物水平上利用超氧阴离子荧光蛋白指示剂测定不同的生理病理条件下活性氧的变化 (a)超氧阴离子荧光蛋白指示剂转基因小鼠模型的建立 首先将实施例1中扩增的mt-cpYFP基因分别克隆到pUC-CAGGS载体(HiroakiHonda，Koichiro Harada，Issei Komuro，Fumio Terasaki，Hiroo Ueno，Yuji Tanaka，Keishiro Kawamura，Yoshio Yazaki and Hisamaru Hirai.(1999).Heart-specificactivation of LTK results in cardiac hypertrophy，cardiomyocyte degenerationand gene reprogramming in transgenic mice.Oncogene，183821-3830)(北京大学)的XhoI位点及pBSIISK(+_)-α-MHC载体(Tomoaki Osugi，Yuichi Oshima，Yasushi Fujio，Masanobu Funamoto，Atsuko Yamashita，Shinji Negoro，KeitaKunisada，Masahiro Izumi，Yoshikazu Nakaoka，Hisao Hirota，Masaru Okabe，KeikoYamauchi-Takihara，Ichiro Kawase，and Tadamitsu Kishimoto. (2002).Cardiac-specific Activation of Signal Transducer and Activator ofTranscription 3 Promotes Vascular Formation in the Heart.J.Bio.Chem.2776676-6681.)(北京大学)的HindIII和EcoRV位点间，构建重组表达载体pUC-CAGGS-mt-cpYFP和pBKSII-α-MHC-mt-cpYFP，然后将pUC-CAGGS-mt-cpYFP和pBKSII-α-MHC-mt-cpYFP分别利用NotI和ScaI酶切进行线性化，利用显微注射的方式将线性化的pUC-CAGGS-mt-cpYFP和pBKSII-α-MHC-mt-cpYFP分别转入ICR小鼠受精卵母细胞中，获得转pUC-CAGGS-mt-cpYFP载体的新生小鼠和转pBKSII-α-MHC-SV40mt-cpYFP载体的新生小鼠；转pUC-CAGGS-mt-cpYFP载体的新生小鼠全身性表达mt-cpYFP蛋白，转pBKSII-α-MHC-mt-cpYFP载体的新生小鼠心脏特异性表达mt-cpYFP蛋白。提取新生小鼠的基因组，并以其作为模板，利用PCR的方式进行基因鉴定，筛选转入了超氧阴离子荧光蛋白指示剂的转基因小鼠。
鉴定转pUC-CAGGS-mt-cpYFP载体的小鼠的引物P1和P2的序列如下 P1TTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTAC P2GACTGGAAGCTCAGGTAGTGGTT 鉴定转pBKSII-α-MHC-mt-cpYFP载体的小鼠的引物P3和P4的序列如下 P3AGTTAACCAGGTGAGAATGTTTCC P4ATGATATAGACGTTGTCGCTGTTG (b)整体水平测定心脏中超氧阴离子的变化 将mt-cpYFP的转基因小鼠麻醉后取心脏，主动脉插管，进行Langendorff灌流，灌流心脏放到激光共聚焦显微镜的载物台上，采集心脏表面下大约30μm的荧光信号。
mt-cpYFP的转基因小鼠测定心脏中超氧阴离子变化的实验结果如图6，在整体心脏上也观测到了超氧炫。
图6中左上角的图是实验模式图，用结扎线将心脏主动脉固定在插管上。图6中间的图是跳动心脏表面(或近表面)的心肌细胞的二维图像。图6下部分的图为心肌细胞中两个发生超氧炫的线粒体(1，2)和一个静息的线粒体(3)的荧光强度随时间变化的曲线。
因此，利用mt-cpYFP的转基因小鼠模型，结合病理模型，能够实时测定不同病理生理条件下活性氧的变化。
序列表
<110>北京大学
<120>氨基-羧基端互换的黄色荧光蛋白的新用途
<130>CGGNARW81480
<160>4
<210>1
<211>249
<212>PRT
<213>多管水母属的维多利亚多管水母(Aequorea victoria)
<400>1
Tyr Asn Ser Asp Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly
1 5 10 15
Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly Val
20 25 30
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro
35 40 45
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Phe Gln Ser Ala Leu Ser
50 55 60
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
65 70 75 80
Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Val Asp
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Thr Gly Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr
100 105 110
Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His
115 120 125
Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Gly Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys
130 135 140
Leu Thr Leu Lys Leu Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp
145 150 155 160
Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe Gly Tyr Gly Leu Lys Cys Phe Ala Arg
165 170 175
Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro
180 185 190
Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn
195 200 205
Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn
210 215 220
Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu
225 230 235 240
Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Gly Thr
245
<210>2
<211>268
<212>PRT
<213>多管水母属的维多利亚多管水母(Aequorea victoria)
<400>2
Leu Ser Leu Arg Gln Ser Ile Arg Phe Phe Lys Arg Ser Gly Ile Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gly Tyr Asn Ser Asp Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln
20 25 30
Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp
35 40 45
Gly Gly Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly
50 55 60
Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Phe Gln Ser
65 70 75 80
Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu
85 90 95
Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr
100 105 110
Lys Val Asp Gly Gly Ser Gly Gly Thr Gly Val Ser Lys Gly Glu Glu
115 120 125
Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val
130 135 140
Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr
145 150 155 160
Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Leu Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro
165 170 175
Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe Gly Tyr Gly Leu Lys Cys
180 185 190
Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser
195 200 205
Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp
210 215 220
Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr
225 230 235 240
Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly
245 250 255
Asn Ile Leu Gly Hi s Lys Leu Glu Tyr Asn Gly Thr
260 265
<210>3
<211>753
<212>DNA
<213>多管水母属的维多利亚多管水母(Aequorea victoria)
<400>3
atgtacaaca gcgacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggcc 60
aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcggcgtgc agctcgccga ccactaccag120
cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcttc180
cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc240
gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaaggtcga cggtggcagc300
ggtggcaccg gtgtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc360
gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat420
gccacctacg gcaagctgac cctgaagctc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc480
tggcccaccc tcgtgaccac cttcggctac ggcctgaagt gcttcgcccg ctaccccgac540
cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc600
accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc660
gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc720
ctggggcaca agctggagta caacggtacc taa 753
<210>4
<211>810
<212>DNA
<213>多管水母属的维多利亚多管水母(Aequorea victoria)
<400>4
atgctgagcc tgcgccagag catccgcttc ttcaagcgca gcggcatcgg gtctgcaggc 60
tacaacagcg acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggccaac120
ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc ggcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag180
aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcttccag240
tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg300
accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca aggtcgacgg tggcagcggt360
ggcaccggtg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag420
ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc480
acctacggca agctgaccct gaagctcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg540
cccaccctcg tgaccacctt cggctacggc ctgaagtgct tcgcccgcta ccccgaccac600
atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc660
atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac720
accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg780
gggcacaagc tggagtacaa cggtacctaa 810
权利要求
1、如下a)或b)的蛋白作为活性氧荧光蛋白指示剂的应用；
a)其氨基酸序列是序列表中的序列1；
b)其氨基酸序列是序列表中的序列2。
2、如下1)或2)的基因在制备活性氧荧光蛋白指示剂中的应用；
1)其核苷酸序列是序列表中的序列3；
2)其核苷酸序列是序列表中的序列4。
3、一种能监测超氧阴离子变化的动物模型的构建方法，是将如下1)或2)的基因导入动物受精卵母细胞中，获得能监测超氧阴离子变化的转基因动物模型；
1)其核苷酸序列是序列表中的序列3；
2)其核苷酸序列是序列表中的序列4。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述动物为ICR小鼠。
全文摘要
本发明公开了一种氨基-羧基端互换的黄色荧光蛋白的新用途。本发明的氨基-羧基端互换的黄色荧光蛋白可作为活性氧荧光蛋白指示剂。本发明还公开了一种能监测超氧阴离子变化的动物模型的构建方法。本发明的活性氧荧光蛋白指示剂可在细胞中定位、实时测定超氧阴离子的变化，能监测超氧阴离子变化的动物模型可实时测定不同的生理病理条件下不同组织的活性氧变化。
文档编号G01N33/68GK101315366SQ20081011669
公开日2008年12月3日 申请日期2008年7月15日 优先权日2008年7月15日
发明者程和平, 王显花, 敏 陈, 铭 郑, 方华强, 张宛睿, 王艳茹 申请人:北京大学