一种优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy及其制备方法和应用的制作方法
一种优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy及其应用，成熟甘露聚糖酶氨基酸序列中的第85位氨基酸亮氨酸（L）改为天冬氨酸（D），第103位氨基酸天冬酰胺（N）改为天冬氨酸（D）。改造后的甘露聚糖酶最适pH值6.0，与原始甘露聚糖酶（最适pH值7.0）相比有了较大改善，且耐酸性进一步提高，在pH4.0-7.0之间均可保持最大酶活力的80%以上，在pH3.0情况下也可保持40%的最大酶活力。本发明研究了改造后甘露聚糖酶的酶学性质，为酶的应用提供了较好的实验数据。
【专利说明】—种优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程与酶工程领域，具体涉及一种优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)是一类能水解甘露聚糖的半纤维素酶，来源比较广泛，绝大部分发现于微生物和一些植物的种子和果实等储藏器官中，甚至在某些低等动物体内也有存在。甘露聚糖酶因来源不同而性质有很大差异。一般来说，细菌中甘露聚糖酶的分子量多在35kD~55kD之间，最适pH值为弱酸性或中性，其中一些嗜碱性芽孢杆菌的最适pH值可达到9.0~10.0。而真菌来源的β -甘露聚糖酶分子量约为45kD~55kD，最适pH值为4.5~5.5。相对于细菌,真菌来源甘露聚糖酶的pH稳定性,最适pH值都偏低，耐热性也比细菌差。植物细胞产生的甘露聚糖酶分子量大约为35kD~45kD，最适反应pH为4.5~5.5，最适反应温度和耐热性比细菌和真菌都低。
[0003]到目前为止，已经发现近千种甘露聚糖酶，不同特色的甘露聚糖酶应用在饲料、食品、制浆及石油天然气行业中，其中在饲料行业中应用最为广泛。豆柏，棉柏，菜柏是最常用的植物蛋白原料，但是单胃家禽(包括猪和鸡)对豆柏的能量利用率仅有50-60%。这是因为豆柏中含有22.7%左右的半纤维素。而这些非淀粉多糖是不能被单胃动物消化。β -甘露聚糖在豆柏中的含量比其它的常用饲料都高，作为一种抗营养因子β -甘露聚糖在动物的消化道内形成凝胶状，使消化道内容物具有较强的黏性，从而影响动物的营养吸收。甘露聚糖酶的添加主要 作用是降低食糜粘度，提高动物对饲料的利用率等。由于单胃家禽等消化系统对酶的一些性质如PH值有着特殊的要求，为了使甘露聚糖酶酶更好的在饲料中发挥作用，通常会选用最适作用PH与消化系统的pH相接近的甘露聚糖酶，近些年，随着分子生物学和基因工程的发展，可以人为对甘露聚糖酶进行合理改造，使其更适合于饲料工业。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种通过定点突变得到的优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy及其制备方法和应用，突变后的甘露聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，本发明通过定点突变甘露聚糖酶氨基酸序列来提高其耐酸性，本发明的另一目的是提供编码上述突变的耐酸性甘露聚糖酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。
[0005]本发明还提供了包含上述突变得到耐酸性甘露聚糖酶基因MAN26gy的重组载体，优选为pET-30a-MAN26gy。将突变得到的耐酸性甘露聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的甘露聚糖酶基因插入到质粒pET_30a上的Nde I和Not I限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pET-30a-MAN26gy。[0006]所述的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy的制备方法，它包括以下步骤:
[0007]I)用含有甘露聚糖酶MAN26gy的编码基因man26gy的的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0008]2)培养重组菌株，诱导重组甘露聚糖酶表达；
[0009]3)回收并纯化所表达的甘露聚糖酶MAN26gy。
[0010]本发明还提供了所述的耐高温甘露聚糖酶MAN26gy在制备饲料添加剂中的应用。
[0011]与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是:本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，通过定点突变提供一种具有较好耐酸性、适合于在饲料工业中应用的甘露聚糖酶。由于动物消化系统对酶的一些性质如PH值有着特殊的要求，为了使本发明的甘露聚糖酶酶更适合于饲料工业，本发明通过定点突变枯草芽孢杆菌GH26 β -甘露聚糖酶氨基酸序列，对该甘露聚糖酶耐酸性进行改造。
[0012]本发明模拟GH26i3_甘露聚糖酶的蛋白空间结构，并进行多序列比对分析，通过重叠PCR技术进行定点突变，具体的为将第85位的亮氨酸和103位天冬酰胺突变为天冬氨酸，并将突变后的甘露聚糖酶基因连接至表达载体pET-30a，将连接后的重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)，获得了一株重组菌株pET-30a-MAN26gy/E.coliBL21 (DE3)。得到的突变后的甘露聚糖酶MAN26gy具有以下性质:改造后的甘露聚糖酶最适pH值6.0，与原始甘露聚糖酶(最适pH值7.0)相比有了较大改善，且耐酸性进一步提高，在pH4.0-7.0之间均可保持最大酶活力的80%以上，在ρΗ3.0情况下也可保持40%的最大酶活力。本发明研究了改造后甘露聚糖酶的酶学性质，为酶的应用提供了较好的实验数据。
[0013]结合阅读本发明的【具体实施方式】后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。`【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1表明本发明突变后重组甘露聚糖酶的蛋白结构。
[0015]图2表明本发明突变后重组甘露聚糖酶的蛋白电泳图谱。
[0016]图3表明本发明突变后重组甘露聚糖酶的最适pH。
[0017]图4表明本发明原始甘露聚糖酶的最适pH。
[0018]图5表明本发明突变后重组甘露聚糖酶的pH稳定性。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
[0020]以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J-萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
[0021]实施例1
[0022]一、GH26 β -甘露聚糖酶基因的定点突变
[0023]本发明所述甘露聚糖酶MAN26gy来源于枯草芽孢杆菌(来源于市售的枯草芽孢杆菌均可，如购于农业微生物菌种保藏中心，其编号为ACCC01779)，甘露聚糖酶MAN26gy的氨基酸序列如下述SEQ ID No:1:
[0024]LFKKHTISLLILFLLASAVLAKPIEAHTVSPVNPNAQQTTKAVMNWLAHLPNRTENRVLSGAFGGYSHDTFSMAEADRIRSATGLSPAIYGCDYARGWLETAEIEDSIDVSCNGDLISYWKNGGIPQISLHLANPAFQSGHFKTPI
【权利要求】
1.一种优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy，其特征在于，所述甘露聚糖酶MAN26gy的最佳pH值是6.0。
3.权利要求1所述的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy的编码基因其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.包含权利要求3所述编码基因j的重组载体。
5.根据权利要求4所述的含有编码基因j的重组载体，其特征在于重组载体优选为重组载体pET-30a-MAN26gy，它由所述甘露聚糖酶基因插入到质粒pET-30a上的斯/e I和Afoi I限制性酶切位点之间而得。
6.包含权利要求3所述编码基因j的重组菌株，其特征在于所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌。
7.权利要求1所述的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy的制备方法，其特征在于它包括以下步骤: 1)用含有甘露聚糖酶MAN26gy的编码基因知；f的的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2)培养重组菌株，诱导重组甘露聚糖酶表达； 3)回收并纯化所表达的甘露聚糖酶MAN26gy。
8.权利要求1所述的耐高温甘露`聚糖酶MAN26gy在制备饲料添加剂中的应用。
【文档编号】A23K1/165GK103695394SQ201310700087
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】张大伟, 杜彦龙, 张明俊, 赵志强 申请人:青岛根源生物技术集团有限公司
【专利摘要】本发明提供了一种优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy及其应用，成熟甘露聚糖酶氨基酸序列中的第85位氨基酸亮氨酸（L）改为天冬氨酸（D），第103位氨基酸天冬酰胺（N）改为天冬氨酸（D）。改造后的甘露聚糖酶最适pH值6.0，与原始甘露聚糖酶（最适pH值7.0）相比有了较大改善，且耐酸性进一步提高，在pH4.0-7.0之间均可保持最大酶活力的80%以上，在pH3.0情况下也可保持40%的最大酶活力。本发明研究了改造后甘露聚糖酶的酶学性质，为酶的应用提供了较好的实验数据。
【专利说明】—种优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程与酶工程领域，具体涉及一种优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)是一类能水解甘露聚糖的半纤维素酶，来源比较广泛，绝大部分发现于微生物和一些植物的种子和果实等储藏器官中，甚至在某些低等动物体内也有存在。甘露聚糖酶因来源不同而性质有很大差异。一般来说，细菌中甘露聚糖酶的分子量多在35kD~55kD之间，最适pH值为弱酸性或中性，其中一些嗜碱性芽孢杆菌的最适pH值可达到9.0~10.0。而真菌来源的β -甘露聚糖酶分子量约为45kD~55kD，最适pH值为4.5~5.5。相对于细菌,真菌来源甘露聚糖酶的pH稳定性,最适pH值都偏低，耐热性也比细菌差。植物细胞产生的甘露聚糖酶分子量大约为35kD~45kD，最适反应pH为4.5~5.5，最适反应温度和耐热性比细菌和真菌都低。
[0003]到目前为止，已经发现近千种甘露聚糖酶，不同特色的甘露聚糖酶应用在饲料、食品、制浆及石油天然气行业中，其中在饲料行业中应用最为广泛。豆柏，棉柏，菜柏是最常用的植物蛋白原料，但是单胃家禽(包括猪和鸡)对豆柏的能量利用率仅有50-60%。这是因为豆柏中含有22.7%左右的半纤维素。而这些非淀粉多糖是不能被单胃动物消化。β -甘露聚糖在豆柏中的含量比其它的常用饲料都高，作为一种抗营养因子β -甘露聚糖在动物的消化道内形成凝胶状，使消化道内容物具有较强的黏性，从而影响动物的营养吸收。甘露聚糖酶的添加主要 作用是降低食糜粘度，提高动物对饲料的利用率等。由于单胃家禽等消化系统对酶的一些性质如PH值有着特殊的要求，为了使甘露聚糖酶酶更好的在饲料中发挥作用，通常会选用最适作用PH与消化系统的pH相接近的甘露聚糖酶，近些年，随着分子生物学和基因工程的发展，可以人为对甘露聚糖酶进行合理改造，使其更适合于饲料工业。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种通过定点突变得到的优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy及其制备方法和应用，突变后的甘露聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，本发明通过定点突变甘露聚糖酶氨基酸序列来提高其耐酸性，本发明的另一目的是提供编码上述突变的耐酸性甘露聚糖酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。
[0005]本发明还提供了包含上述突变得到耐酸性甘露聚糖酶基因MAN26gy的重组载体，优选为pET-30a-MAN26gy。将突变得到的耐酸性甘露聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的甘露聚糖酶基因插入到质粒pET_30a上的Nde I和Not I限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pET-30a-MAN26gy。[0006]所述的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy的制备方法，它包括以下步骤:
[0007]I)用含有甘露聚糖酶MAN26gy的编码基因man26gy的的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0008]2)培养重组菌株，诱导重组甘露聚糖酶表达；
[0009]3)回收并纯化所表达的甘露聚糖酶MAN26gy。
[0010]本发明还提供了所述的耐高温甘露聚糖酶MAN26gy在制备饲料添加剂中的应用。
[0011]与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是:本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，通过定点突变提供一种具有较好耐酸性、适合于在饲料工业中应用的甘露聚糖酶。由于动物消化系统对酶的一些性质如PH值有着特殊的要求，为了使本发明的甘露聚糖酶酶更适合于饲料工业，本发明通过定点突变枯草芽孢杆菌GH26 β -甘露聚糖酶氨基酸序列，对该甘露聚糖酶耐酸性进行改造。
[0012]本发明模拟GH26i3_甘露聚糖酶的蛋白空间结构，并进行多序列比对分析，通过重叠PCR技术进行定点突变，具体的为将第85位的亮氨酸和103位天冬酰胺突变为天冬氨酸，并将突变后的甘露聚糖酶基因连接至表达载体pET-30a，将连接后的重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)，获得了一株重组菌株pET-30a-MAN26gy/E.coliBL21 (DE3)。得到的突变后的甘露聚糖酶MAN26gy具有以下性质:改造后的甘露聚糖酶最适pH值6.0，与原始甘露聚糖酶(最适pH值7.0)相比有了较大改善，且耐酸性进一步提高，在pH4.0-7.0之间均可保持最大酶活力的80%以上，在ρΗ3.0情况下也可保持40%的最大酶活力。本发明研究了改造后甘露聚糖酶的酶学性质，为酶的应用提供了较好的实验数据。
[0013]结合阅读本发明的【具体实施方式】后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。`【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1表明本发明突变后重组甘露聚糖酶的蛋白结构。
[0015]图2表明本发明突变后重组甘露聚糖酶的蛋白电泳图谱。
[0016]图3表明本发明突变后重组甘露聚糖酶的最适pH。
[0017]图4表明本发明原始甘露聚糖酶的最适pH。
[0018]图5表明本发明突变后重组甘露聚糖酶的pH稳定性。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
[0020]以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J-萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
[0021]实施例1
[0022]一、GH26 β -甘露聚糖酶基因的定点突变
[0023]本发明所述甘露聚糖酶MAN26gy来源于枯草芽孢杆菌(来源于市售的枯草芽孢杆菌均可，如购于农业微生物菌种保藏中心，其编号为ACCC01779)，甘露聚糖酶MAN26gy的氨基酸序列如下述SEQ ID No:1:
[0024]LFKKHTISLLILFLLASAVLAKPIEAHTVSPVNPNAQQTTKAVMNWLAHLPNRTENRVLSGAFGGYSHDTFSMAEADRIRSATGLSPAIYGCDYARGWLETAEIEDSIDVSCNGDLISYWKNGGIPQISLHLANPAFQSGHFKTPI
【权利要求】
1.一种优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy，其特征在于，所述甘露聚糖酶MAN26gy的最佳pH值是6.0。
3.权利要求1所述的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy的编码基因其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.包含权利要求3所述编码基因j的重组载体。
5.根据权利要求4所述的含有编码基因j的重组载体，其特征在于重组载体优选为重组载体pET-30a-MAN26gy，它由所述甘露聚糖酶基因插入到质粒pET-30a上的斯/e I和Afoi I限制性酶切位点之间而得。
6.包含权利要求3所述编码基因j的重组菌株，其特征在于所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌。
7.权利要求1所述的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy的制备方法，其特征在于它包括以下步骤: 1)用含有甘露聚糖酶MAN26gy的编码基因知；f的的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2)培养重组菌株，诱导重组甘露聚糖酶表达； 3)回收并纯化所表达的甘露聚糖酶MAN26gy。
8.权利要求1所述的耐高温甘露`聚糖酶MAN26gy在制备饲料添加剂中的应用。
【文档编号】A23K1/165GK103695394SQ201310700087
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】张大伟, 杜彦龙, 张明俊, 赵志强 申请人:青岛根源生物技术集团有限公司
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