专利名称：：一种制备β-甘露聚糖酶的方法及其专用菌株的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种制备P-甘露聚糖酶的方法及其专用菌株。
背景技术：
：甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，是由P-1，4-D-甘露糖连接而成的线状多聚体，在多糖的侧链上主要有葡萄糖基、乙酰基和半乳糖基等取代基团，其来源丰富，在魔芋粉、槐豆胶、沙蒿胶、瓜儿豆胶中都有不同种类的甘露聚糖存在。p-1，4-D-甘露聚糖酶((3-1，4-D-mannanmannohydrolase;EC.3.2.1.78)，简称3-甘露聚糖酶(P-mannanase)，是一类能够水解含有P-1，4-D-甘露糖苷键的甘露寡糖和甘露多糖的内切水解酶，广泛存在于动物、植物和微生物中。|3-甘露聚糖酶作为一种半纤维素酶，是水解甘露聚糖最关键的酶，可广泛应用于食品、造纸、饲料、纺织、印染等行业，具有很大的应用前景和生产价值。其中微生物来源的e-甘露聚糖酶具有活性高、成本低、来源稳定、提取方便等显著特点，具有广阔的应用前景。(3-甘露聚糖酶的研究始于20世纪50年代末，早期的研究着重于产酶菌株的筛选、酶的分离纯化以及酶学性质，并将其作为工具酶应用于天然多糖类物质糖链结构的分析。80年代e-甘露聚糖酶的研究开始向应用和产业化方向发展。迄今，微生物产P-甘露聚糖酶发酵的研究主要集中于黑曲霉菌0^;^^^'^^)和芽孢杆菌Gfew77^)，而芽孢杆菌中研究较多的是枯草芽孢杆菌09acW7iAs幼力""s)、地衣芽抱杆菌(^3Cj7Jw517ic力e/2i/hnzw'5)禾口嗜减芽抱杆菌(alkalophilic^feci72〃ssp.)，且以枯草芽孢杆菌产酶活性最高。国内有关微生物产e-甘露聚糖酶的报道也以中温微生物为主芽孢杆菌M-21以瓜儿豆胶为碳源，酵母膏、蛋白胨为氮源，在32X:下液体发酵培养，其产酶水平为1487U/mL(周芳，牟海津，江晓路.芽孢杆菌M-21产e-甘露聚糖酶发酵条件研究[J].食品与发酵工业，2007，33:10-14);嗜热枯草芽孢杆菌WY45和WY34以魔芋粉为碳源，酵母提取物和胰蛋白胨为氮源，在5(TC条件下液体发酵培养，产(3-甘露聚糖酶的水平分别为2800U/mL(柴萍萍，韦赞，江正强,李里特，日下部功.枯草芽孢杆菌WY45产P-甘露聚糖酶发酵条件优化[J].中国农业大学学报，2005，10(3):77—80)禾口1105U/mL(Jiang，Z.Q,，Wei,Y.，Li，D.Y.，Li，LT"Chai，P.P.andKusakabe，I.High-levelproduction,purificationandcharacterizationofathermostable(3-mannanasefromthenewlyisolated5aci77zAss〃Zfi7i6"WY34[J].CarbohydratePolymers,2006，66:88-96)。国内外关于天然微生物液体发酵生产甘露聚糖酶的专利申请较少，且产酶量偏低，其中专利号为01144782.6的专利中公开了一种以黑曲霉出发菌株生产液体发酵生产酸性甘露聚糖酶，酶活为150U/mL。而国外专利中的产酶活力也在2000U/mL以下。专利号为200810229197.O的专利中公开了一种以毕赤酵母表达甘露聚糖酶基因的工程菌株进行发酵罐液体发酵产甘露聚糖酶，发酵70-100h酶活可以达到23320U/mL，但产酶周期偏长。专利号为200510032497.6的专利中公开了一种采用欧文氏杆菌变异菌株CXJZ95-198发酵罐液体发酵产甘露聚糖酶，酶活为180U/mL。以上水平应用于工业生产甘露聚糖酶水平偏低，且生产周期长和发酵成本较高。
发明内容本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌菌株。该菌株经过发酵可以高效生产卩-甘露聚糖酶。本发明提供的枯草芽孢杆菌(^3cj77m^;Z^i乃's)TT-68已于2009年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCCN2.3340。本发明的另一目的在于提供一种制(3-甘露聚糖酶的方法。本发明提供的方法是将上述的枯草芽孢杆菌TT-68发酵，得到P-甘露聚糖酶。上述发酵用的发酵培养基包括30-50g/L的碳源、5-8g/L的氮源、3-7g/L的KH2P04和0.2-0.5g/L的MgS047H20。上述碳源可以是魔芋精粉、花芋粉、魔芋胶、槐豆胶和瓜尔豆胶中的至少一种；上述氮源可以是酵母提取物、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、玉米浆、豆粕粉和棉籽粕中的至少一种。为了进一步提高酶的产率，可在上述发酵培养基中加入氨基酸和/或维生素。上述氨基酸可以是L-异亮氨酸、DL-白氨酸和/或L-缬氨酸；上述维生素可以是核黄素、盐酸吡哆辛和/或抗坏血酸。上述发酵培养基可以按照如下方法配制魔芋精粉30-50g，豆粕粉5-8g，KH2P043-7g，MgS04*7H200.2-0.5g，L-缬氨酸2g，盐酸吡哆辛0.5mg，加水到lL，自然pH。进一步，上述发酵培养基是按照如下方法配制魔芋精粉40-50g，豆粕粉7g，KH2P045g，MgS047H200.3g，L-缬氨酸2g，盐酸吡哆辛0.5mg，加水到lL，自然pH。上述发酵是可在摇瓶中、5L发酵罐中或5吨发酵罐中进行。上述发酵在摇瓶中进行时，所述发酵条件是温度40-55°C，转速为100-220rpm，旋转半径是12mm;上述发酵在5L发酵罐中进行时，所述发酵条件是温度40-55°C，通气量为1-2vvm，搅拌速率为300-600rpm;上述发酵在5吨发酵罐中进行时，所述发酵条件是温度40-55。C，通气量为1-1.5vvm，搅拌速率为150-300rpm。实验证明采用上述菌株和上述方法，通过摇瓶产酶发酵培养，产酶水平为6200-12000U/raL，比之前国内研究的产酶水平有较大提高。进行5L和5吨发酵罐扩大培养48h，酶活分别可达到8500-20000U/mL和11000-28000U/mL，是目前相关报道中的最高水平。本发明的来源(魔芋精粉、豆粕粉等)广泛，价格便宜，降低了生产成本。该方法生产P-甘露聚糖酶产酶水平高，发酵周期短，生产成本低，具有较好的工业化应用前景。图1为不同碳源对枯草芽孢杆菌TT-68摇瓶液体发酵产p-甘露聚糖酶活性的影响。图2为不同氮源对枯草芽孢杆菌TT-68摇瓶液体发酵产P-甘露聚糖酶活性的影响。图3为氨基酸对枯草芽孢杆菌TT-68摇瓶液体发酵产p-甘露聚糖酶活性的影响。图4为维生素对枯草芽孢杆菌TT-68摇瓶液体发酵产P-甘露聚糖酶活性的影响。具体实施例方式主要原料及试剂槐豆胶、瓜尔豆胶购自瑞士SIGMA公司；酵母提取物、胰蛋白胨购自OXOID公司；氨基酸和维生素均购自北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、豆粕粉、棉籽粕和玉米浆购自北京康明威培养基技术有限责任公司。KH2P04、MgS(W貼、NaCl、NaOH、苯酚、无水亚硫酸钠分析纯，购自北京化工厂；魔芋精粉(产品型号3A，执行标准NY/T494—2002，乳白色颗粒状，粒度60-100目，粘度^20000rapa.s，有效物质含量大于90%。注普通魔芋粉粒度在0-65目。)、花芋粉(产品型号3A，执行标准NY/T494_2002，淡黄色颗粒状，粒度0-65目，粘度》20000mpa.s，有效物质含量大于90%。)、魔芋胶(产品规格03-TK，执行标准NY/T494-2002，白色粉末状，粒度0-65目，粘度40000mpa.s，有效物质含量大于90%。)购自武汉市清江魔芋制品有限公司；3，5-二硝基水杨酸购自上海远帆制剂厂。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。本发明所提供的枯草芽孢杆菌TT-68是从土壤腐叶中筛选得到的。枯草芽孢杆菌TT-68已于2009年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCNa.3340。本发明所提供的枯草芽孢杆菌TT-68的细菌学特征为菌落呈乳白色，圆形或近圆形，边缘较整齐，中央隆起，干燥褶铍，不透明，不产生色素，菌落直径2-3mm，显微镜检为短杆状，长1.5-3.0ym，直径0.6-0.7um，产芽孢。生理生化特征为革兰氏阳性、好氧、化能异养菌，V-P反应、接触酶、葡萄糖发酵、硝酸盐还原呈阳性，甲基红反应呈阴性，其生长能水解淀粉、明胶。实施例1、摇瓶培养条件的筛选一、发酵培养基中碳源的筛选1、菌种活化将保藏的菌种TT-68在平板活化培养基上进行活化。上述活化培养基可以按照以下方法进行配制槐豆胶IOg，酵母提取物6g，牛肉膏蛋白胨4g，KH2P045g，MgS047H200.3g，琼脂15g加水到1L，自然pH。2、种子液制备将活化后的新鲜菌株接种到种子培养基中培养。上述种子培养基可以按照以下方法进行配制酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g，加水到1L，自然pH。3、摇瓶液体发酵生产p-甘露聚糖酶在250mL三角瓶中装入50mL发酵培养基，接入1.5%(体积百分比)种子液，在5(TC恒温空气浴摇床上以180rpm振荡培养4d，将发酵后的发酵液10000rpm离心IOrain，取上清作为粗酶液，进行(3-甘露聚糖酶酶活测定。其中，发酵培养基按照以下方法进行配制碳源30g，酵母提取物6g，KH2P045g，MgS04'7H200.3g，加水到1L，自然pH。实验根据碳源的种类不同，设5种培养基，其碳源分别是魔芋精粉、花芋粉、魔芋胶、槐豆胶和瓜尔豆胶。其中，酶活测定是采用DNS法(3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和棕红色物的颜色深浅呈一定比例关系。在540nm波长下测定棕红色物质的吸光度值，便可求出样品中还原糖的含量。)进行酶活测定(Miller,G丄Useofdinitrosalicylicacidreagentfordeterminationofreducingsugars[J].AnalyticalChemistry,1959，31:426-428)。具体方法如下在0.9mL0.5%的槐豆胶底物(50mM，pH6.0的柠檬酸缓冲液配制)中加入适当稀释的酶液0.1mL，60。C水浴中反应10min，用DNS试剂(1%3，5-二硝基水杨酸，l%Na0H，0.2%苯酚，使用蒸馏水配制作为储存液，使用前加入0.05%的无水亚硫酸钠)测定产生的还原糖量，以D-甘露糖为标准。上述反应条件下，每分钟产生1拜olD-甘露糖所需要的酶量为1个酶活性单位(U)。实验设三次重复。碳源对TT-68产P-甘露聚糖酶活性的影响如图1所示，以魔芋精粉为碳源培养产酶最高，可达到2400U/mL。二、发酵培养基中氮源的筛选1、菌种活化步骤二的菌种活化与上述步骤一的方法完全一样。2、种子液制备步骤二的种子液制备与上述步骤一的方法完全一样。3、摇瓶液体发酵生产P-甘露聚糖酶步骤二的摇瓶液体发酵生产P-甘露聚糖酶与步骤一的区别在于发酵培养基不同，其余步骤完全相同。本步骤的发酵培养基按照以下方法进行配制魔芋精粉30g，氮源6g，KH2P045g，MgS047H200.3g，加水到1L，自然pH。本实验根据氮源的种类不同，设7种培养基，其氮源分别是酵母提取物、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、豆粕粉、棉籽粕和玉米浆。实验设三次重复。按照步骤一提供的方法进行p-甘露聚糖酶酶活测定以及蛋白含量测定。氮源对TT-68产p-甘露聚糖酶活性的影响如图2所示，以豆粕粉为氮源培养产酶最高，可达到4800U/mL。三、发酵培养基中氨基酸的筛选1、菌种活化步骤三的菌种活化与上述步骤二的方法完全一样。2、种子液制备步骤三的种子液制备与上述步骤二的方法完全一样。3、摇瓶液体发酵生产(3-甘露聚糖酶步骤三的摇瓶液体发酵生产(3-甘露聚糖酶与步骤二的区别在于发酵培养基不同，其余步骤完全相同。本步骤的发酵培养基按照以下方法进行配制魔芋精粉30g，豆粕粉6g，KH2P045g，MgS047H200.3g，氨基酸2g，加水到1L，自然pH。本实验根据氨基酸的种类不同，设3种培养基，其氨基酸分别是L-异亮氨酸、DL-白氨酸和L-缀氨酸。实验设三次重复。按照步骤一提供的方法进行(3-甘露聚糖酶酶活测定以及蛋白含量测定。不同氨基酸对TT-68产P-甘露聚糖酶活性的影响如图3(Control为不加氨基酸的对照，L-Isoleucine为L-异亮氨酸)所示，氨基酸中L-异亮氨酸、DL-白氨酸、L-纈氨酸对产酶有较大提高，其中L-缬氨酸作用最明显，酶活可达到6200U/mL。四、发酵培养基中维生素的筛选1、菌种活化步骤四的菌种活化与上述步骤三的方法完全一样。2、种子液制备步骤四的种子液制备与上述步骤三的方法完全一样。3、摇瓶液体发酵生产(3-甘露聚糖酶步骤四的摇瓶液体发酵生P-甘露聚糖酶与步骤三的区别在于发酵培养基不同，其余步骤完全相同。本步骤的发酵培养基按照以下方法进行配制魔芋精粉30g，豆粕粉6g，KH2P045g，MgS04*7H200.3g，维生素0.5mg，加水到1L，自然pH。本实验根据维生素的种类不同，设3种培养基，其中维生素分别是核黄素、盐酸吡哆辛和抗坏血酸。实验设三次重复。按照步骤一提供的方法进行P-甘露聚糖酶酶活测定。不同维生素对TT-68产P-甘露聚糖酶活性的影响如图4(Control为不加维生素的对照)所示，维生素中核黄素、盐酸吡哆辛、抗坏血酸对产酶有较大提高，其中盐酸吡哆辛作用最佳，酶活可达到6600U/mL。五、发酵培养条件的筛选1、菌种活化步骤五的菌种活化与上述步骤四的方法完全一样。2、种子液制备步骤五的种子液制备与上述步骤四的方法完全一样。3、摇瓶液体发酵生产(3-甘露聚糖酶步骤五的摇瓶液体发酵生产|3-甘露聚糖酶与步骤四的区别在于以下三点，其余步骤完全相同1、发酵培养基魔芋精粉(30、40或50g/L)，豆粕粉(5、7或8g/L)，KH2P045g/L，MgS047H200.3g/L，L-缬氨酸2g/L，盐酸吡哆辛0.5mg/L;2、发酵条件接种量(1%、2%或3%)，摇瓶转速(100、160或220rpm)和发酵温度(40、50或55°0;3、发酵时间为6天。其中，不同的魔芋精粉浓度、不同豆粕粉浓度、不同的接种量、不同的转速和不同的培养温度组合成的15个处理见表1。按照步骤一提供的方法进行甘露聚糖酶酶活测定以及蛋白含量测定。实验设三次重复。产酶情况如表l所示，发酵6天，嗜热的枯草芽孢杆菌TT-68摇瓶液体发酵产卩-甘露聚糖酶活性可以达到6200-12000U/mL。表1发酵条件对枯草芽孢杆菌TT-68摇瓶液体发酵产(3-甘露聚糖酶的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例2、在5L发酵罐中发酵1、菌种活化实施例2的菌种活化与实施例1的步骤一的方法完全一样。2、种子液制备实施例2的种子液制备与实施例1的步骤一的方法完全一样。3、摇瓶液体发酵生产P-甘露聚糖酶往5L发酵罐(培养基为2.5L)中分别接入1%、2%和3%(体积百分比)种子液，在不同温度(40、50和55X:)下培养，通气量是l、1.5和2vvm，搅拌速率是300、450和600rpm，发酵周期48h，实验设三次重复。不同的接种量、温度、通气量以及搅拌速率的处理设置见表2。其中，本实施例的发酵培养基按照以下方法进行配制魔芋精粉40g，豆粕粉7g，KH2P045g，MgS047H200.3g，L-缬氨酸2g，盐酸吡哆辛0.5mg，加水到1L，自然pH。按照实施例1的步骤一提供的方法进行p-甘露聚糖酶酶活测定以及蛋白含量测定。不同条件对TT-685L发酵罐发酵产P-甘露聚糖酶活性的影响见表2。嗜热的枯草芽孢杆菌TT-68在5L发酵罐中48h产P-甘露聚糖酶活性可以达到8500-20000U/mL。表2不同发酵条件对嗜热的枯草芽孢杆菌TT-68在5L发酵罐中产P-甘露聚糖酶的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例3、在5吨发酵罐中发酵1、菌种活化实施例3的菌种活化与实施例1的步骤一的方法完全一样。2、一级种子将活化后的新鲜菌株接种到种子培养基中培养，得到一级种子培养液。其中种子培养基与实施例1的步骤一的种子培养基一样。3、二级种子将一级种子培养液接种到二级种子发酵罐中，接种量为1%(体积百分比)，在5(TC下培养，通气量为1.5wm，搅拌速度为250rpm。上述二级种子发酵罐培养基可按照以下方法进行配制魔芋精粉40g，豆粕粉7g，KH2P045g，MgS04'7H200.3g，L-缬氨酸2g，盐酸吡哆辛0.5mg，加水到1L，自然pH。4、在5吨发酵罐中发酵产酶将二级种子培养液接种到5吨发酵罐(发酵培养基占罐体积的75%)中，接种量为2%，在不同温度(40、50和55"C)下培养，通气量为1.5wm，搅拌速率为200rpm，培养时间48h。不同温度和不同转速的处理设置见表3。上述5吨发酵罐的发酵培养基可按照以下方法进行配制魔芋精粉40g，豆粕粉7g,K,45g，MgS04'7H200.3g，L-缬氨酸2g，盐酸吡哆辛0.5mg，加水到1L，自然pH。实验重复3次。按照实施例i的步骤一提供的方法进行e-甘露聚糖酶酶活测定以及蛋白含量测定。培养温度和搅拌速率对TT-68在5吨发酵罐中发酵产p-甘露聚糖酶活性的影响如表3所示，嗜热的枯草芽孢杆菌TT-68在5吨发酵罐中48h产卩-甘露聚糖酶活性可以达到11000-28000U/mL，是目前报道的最高值。表3不同发酵条件对枯草芽孢杆菌TT-68在5吨发酵罐中产(3-甘露聚糖酶的影响因素酶活力(U/mL)温度rc)转速(rpm)4015012084±20120021652±25530019130±2775015023055±23120028000±28030026344±2635515011020±21020024580土24630023125±2311权利要求1、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)TT-68CGMCC№.3340。2、一种制备e-甘露聚糖酶的方法，是将权利要求l所述的枯草芽孢杆菌TT-68发酵，得到e-甘露聚糖酶。3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述发酵用的发酵培养基包括30-50g/L的碳源、5-8g/L的氮源、3-7g/L的KH2P0i和0.2-0.5g/L的MgSC^7H20。4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述碳源是魔芋精粉、花芋粉、魔芋胶、槐豆胶和瓜尔豆胶中的至少一种；所述氮源是酵母提取物、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、玉米浆、豆粕粉和棉籽粕中的至少一种。5、根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述发酵培养基还包括氨基酸和/或维生素。6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述氨基酸是L-异亮氨酸、DL-白氨酸和/或L-缬氨酸；所述维生素是核黄素、盐酸吡哆辛和/或抗坏血酸。7、根据权利要求3-6任一所述的方法，其特征在于所述发酵培养基是按照如下方法配制魔芋精粉30-50g，豆粕粉5-8g，KH2P043-7g，MgS047H200.2-0.5g，L-缬氨酸2g，盐酸吡哆辛0.5mg，加水到lL。8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述发酵培养基是按照如下方法配制魔芋精粉40-50g，豆粕粉7g，KH2P045g，MgS047H200.3g，L-缬氨酸2g，盐酸吡哆辛0.5rag，加水到lL。9、根据权利要求2-8任一所述的方法，其特征在于所述发酵是在摇瓶中、5L发酵罐中或5吨发酵罐中进行。10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述发酵在摇瓶中进行，所述发酵条件是温度40-55°C，转速为100-220rpm，旋转半径是12mm;所述发酵在5L发酵罐中进行，所述发酵条件是温度40-55。C，通气量为1-2vvm,搅拌速率为300-600rpm;所述发酵在5吨发酵罐中进行，所述发酵条件是温度40-55°C，通气量为1-1.5vvm，搅拌速率为150-300rpm。全文摘要本发明公开了一种枯草芽孢杆菌菌株。该菌株TT-68已于2009年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC№.3340。实验证明采用将菌株通过摇瓶产酶发酵培养，产酶水平为6200-12000U/mL，比之前国内研究的产酶水平有较大提高。进行5L和5吨发酵罐扩大培养48h，酶活分别可达到8500-20000U/mL和11000-28000U/mL，是目前相关报道中的最高水平。文档编号C12N9/42GK101671645SQ20091023606公开日2010年3月17日申请日期2009年10月26日优先权日2009年10月26日发明者鹏周,荦唐,唐艳斌,江正强,闫巧娟申请人:中国农业大学