专利名称：一种用于pcr扩增的真菌dna快速提取方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物的DNA提取方法，尤其涉及一种用于PCR扩增的真菌DNA 快速提取方法，属于真菌分子生物学领域。
背景技术：
随着对真菌分子生物学的深入研究，在对真菌进行分子鉴定和分类及其基因的克 隆时需要少量的真菌基因组DNA做模板进行PCR扩增。真菌细胞壁厚，多糖含量高，常用的 真菌DNA提取方法是CTAB法。CTAB法提取的DNA纯度较高，但需要大量菌丝体且步骤繁琐， 首先将真菌菌丝体研磨破壁，高温温育，费时费力。另外也有一些真菌DNA提取方法的报道 但都离不开研磨破壁和酚氯仿抽提蛋白等步骤。上述方法均难以应用于批量的真菌DNA提 取。因此急需一种更为简便快速的方法少量提取真菌DNA用于后续的PCR扩增，以满足对 真菌分子鉴定的需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种快速、简便、经济、 低毒、易行的真菌DNA提取方法， 本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的
—种用于PCR扩增的真菌DNA快速提取方法，包括以下步骤
(1)培养有待提取DNA的真菌，得到真菌菌丝体；
(2)将所培养的真菌菌丝体置于装有裂解液的离心管中；
(3)将离心管交替冻融； (4)离心，取上清转入无菌离心管，加入两倍体积的95%乙醇，颠倒混匀，液氮速 冻后，离心，弃上清，将沉淀风干，用双蒸水或1XTE溶液溶解，即得。 为了达到更佳的提取效果，优选的，步骤(1)中将待提取DNA的真菌在PDA培养基 上进行平板或斜面培养； 优选的，步骤(2)中将真菌菌丝体置于装有100-500 裂解液的微量离心管中； 更优选的，将真菌菌丝体置于装有200 裂解液的微量离心管中；其中，所述裂解液的成 份为10mM Tris-HCl， pH8. 0， ImM EDTA，250mM NaCl， 1% SDS ; 步骤(3)中所述的交替冻融优选为将离心管放置于液氮中速冻后迅速转入沸水 中煎煮；更优选的，将装有真菌菌丝体的离心管中置入液氮速冻中速冻30秒-2分钟然后迅 速转入沸水中煮2-10分钟；最优选的，将装有真菌菌丝体的离心管中置入液氮速冻中速冻 1分钟然后迅速转入沸水中煮5分钟；步骤(3)中的交替冻融次数可以为1-3次，为了达到 更好的裂解效果，交替冻融的次数最好为2次； 步骤(4)中所述的离心在o-4t:的低温条件下进行离心，离心转速优选为 8000-16000rpm，更优选为12000rpm ;其中，第一次离心的时间优选为1_3分钟，更优选为2 分钟；，第二次离心的时间优选为5-15分钟，更优选为10分钟。
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其中，为了提高所提取的DNA的纯度，步骤(4)中将沉淀风干之前，可加入1ml的 75X乙醇洗涤沉淀，4。C，12000rpm离心lmin ; 本发明的方法完全可用于所有的真菌DNA的提取，所述的真菌包括侧耳属真 菌(Pleurotus)，细极链格孢菌(Alternaria te皿issima)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea(Moug. )Ces. &De Not.)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、围小丛壳菌 (Glomerella cingulata)、果生链核盘菌(Moniliniafructigena Honey)、盘长孢状剌盘孢 菌(Colletotrichum gloeosporioides)、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilaci皿s (Thom.) Samson)等。 本发明方法较之传统的CTAB法操作简单，省去了采用液氮研磨步骤，省时省力且 减少了研磨过程中真菌DNA的损失；本发明方法采用液氮和沸水反复冻融，使裂解液中蛋 白和多糖含量比较少，无需再用苯酚和氯仿抽提，避免了有毒试剂的接触，加入乙醇后又用 液氮处理提高了 DNA沉淀效率。本发明方法所提取的DNA完整性好，纯度高，收率高，可直 接用于PCR扩增反应，能够高效扩增出用于克隆和测序的目的产物。本发明方法大大提高 真菌DNA的提取效率，降低了真菌DNA提取的成本，从而可有效提高真菌的分子鉴定和检测 效率，降低鉴定和检测成本。
图1采用本发明方法提取的侧耳属真菌DNA为模板，PCR扩增rDNA-ITS片段琼 脂糖凝胶(1.0% )电泳图；其中泳道1-3为侧耳属剌芹侧耳(Pleurotuseryngii(DC.) Gillet)菌株；泳道1-3为白黄侧耳(Pleurotus geesteya皿s Singer) 3个菌株；泳道4-6 为袖珍侧耳(Pleurotus eryngii (DC.) Gillet) 3个菌株；泳道7-9为虎奶菇(Pleurotus tuber-regi咖(R卿h. ex Fr.) Singer) 3个菌株；泳道10-12为阿魏侧耳(Pleurotus ferulae (Lanzi)X. L.Mao)3个菌株；泳道13—15为长柄平燕(Pleurotus spodoleucus (Fr.) Qu6l. )3个菌株；泳道16-18为平燕(Pleurotus ostreatus (Jacq. ) P. Kumm. ) 3个菌株；泳 道19-24为鲍鱼侧耳(Pleurotus abalo皿s Y. H. Han， K. M. Chen&S. Cheng) 3个菌株；M为 DL2000DNA分子量标准，从上到下依次为5000、 3000、 2000、 1000、 750、 500、 250bp 。
图2采用本发明方法提取的真菌DNA为模板，PCR扩增rDNA-ITS片段琼脂糖凝 胶(1.0%)电泳图；其中泳道1-3为平燕(Pleurotus ostreatus (Jacq. ) P. Kumm. ) 3个 菌株、泳道4-6细极链格孢菌(Alternaria te皿issima) 3个菌株、泳道7-9为葡萄座腔 菌(Botryosphaeria dothidea (Moug. ) Ces. &De Not. )3个菌株、泳道10-12为尖孢镰刀菌 (Fusarium oxysporum) 3个菌株、泳道13-15为围小丛壳菌(Glomerella cingulata) 3个菌 株、泳道16-18为果生链核盘菌(Monilinia fructigena Honey) 3个菌株、泳道19-21为盘 长孢状剌盘孢菌(Colletotrichum gloeosporioides) 3个菌株、泳道22-24为淡紫拟青霉 (Paecilomyces lilaci皿s (Thom.) Samson) 3个菌株，M为DL2000DNA分子量标准，从上到下 依次为5000、3000、2000、1000、750、500、250bp。
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术
4人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 接种侧耳属剌芹侧耳(Pleurotus eryngii (DC. ) Gillet)、白黄侧耳 (Pleurotusgeesteya皿s Singer)、 袖 珍 侧 耳 (Pleurotus eryngii (DC. )Gillet)、 虎奶燕(Pleurotus tuber_regium(Rumph. ex Fr.) Singer)、 阿魏侦[J耳(Pleurotus ferulae (Xanzi) X丄Mao)、 长柄平燕 (Pleurotus spodoleucus (Fr. ) Qu6l.)、 平燕 (Pleurotus ostreatus (Jacq. ) P. Kumm.)、鲍鱼侧耳(Pleurotus abalo皿s Y. H. Han， K. M. Chen& S. Cheng) 8种各3个菌株在PDA培养基3(TC条件下生长一周，接种针挑取少量 的真菌菌丝体放入加有200 ii 1裂解液(10mM Tris-HCl，pH8. 0， ImM EDTA，250mM NaCl， 1% SDS ;新鲜配制)的微量离心管中；液氮速冻lmin，迅速放入沸水中煮5min，重复1次；4°C， 12000rpm离心2min，取上清转入无菌离心管，加入两倍体积的95%乙醇，颠倒混匀，液氮速 冻lmin，4。C， 12000rpm离心10min倒掉上清；加入lml的75%乙醇洗涤沉淀，4°C ， 12000rpm 离心lmin，倒掉上清，将沉淀风干；加入50iU 1XTE溶解DNA， -2(TC保存备用。
用所提取的DNA做模板和真菌通用引物ITS1(5' -GTA GTC ATA TGC TTGTCT C-3' )/ITS4(5' -TCC GCA GGT TCA CCT ACG GA-3 ')进行PCR扩增，除阿魏侧耳 (Pleurotus ferulae (Lanzi) X. L. Mao) —个菌株外其余全部成功扩增到长度约为600左右 的rDNA-ITS片段(图1)，扩增效率为95% 。
实施例2 平燕(Pleurotus ostreatus (Jacq. ) P. Kumm.)、 细极链格孢菌 (Alternariate皿issima)、 葡 萄 座 腔 菌 (Botryosphaeria dothidea(Moug.) Ces. &De Not.)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、围小丛壳菌(Glomerella cingulata)、果生链核盘菌(Monilinia f潔tigena Honey)、芒果炭疽病菌 (Colletotrichumgloeosporioides)、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilaci皿s (Thom.) Samson) 8种各3个菌株在PDA培养基3(TC条件下生长一周，接种针挑取少量的真菌菌丝体 放入加有200 ii 1裂解液(10mM Tris-HCl， pH8. 0， ImM EDTA，250mM NaCl， 1% SDS ;新鲜配 制)的微量离心管，其中对不同裂解液成分做了液氮速冻lmin，迅速放入沸水中煮5min， 重复1次；4。C， 12000rpm离心2min，取上清转入无菌离心管，加入两倍体积的95%乙醇，颠 倒混匀，液氮速冻lmin ;4。C，12000rpm离心10min倒掉上清；加入lml的75%乙醇洗涤沉 淀；4。C，12000rpm离心lmin，倒掉上清，沉淀风干；加入50iU 1XTE溶解DNA， -20。C保存 备用。 用提取的DNA做模板和真菌通用引物ITS1 (5 ' -GTA GTC ATA TGC TTG TCTC-3' )/ITS4(5' -TCC GCA GGT TCA CCT ACG GA-3')进行PCR扩增，除细极链格孢菌 (Alternaria te皿issima) —个菌株外其余全部成功扩增到长度约为600左右的rDNA-ITS 片段(图2)，扩增效率为95%。
权利要求
一种用于PCR扩增的真菌DNA快速提取方法，包括以下步骤(1)培养有待提取DNA的真菌，得到真菌菌丝体；(2)将真菌菌丝体置于装有裂解液的离心管中；(3)将离心管交替冻融；(4)离心，取上清转入无菌离心管，加入两倍体积的95％乙醇，颠倒混匀，用液氮速冻，离心，弃上清，将沉淀风干，即得。
2. 按照权利要求l所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于步骤(1)中将待提取 DNA的真菌在PDA培养基上进行平板或斜面培养。
3. 按照权利要求1所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于步骤(2)中将真菌菌 丝体置于装有100-500 iU裂解液的微量离心管中；优选的，将真菌菌丝体置于装有200 裂解液的微量离心管中其中，所述裂解液的组成成份为10mMTris-HCl， pH8. 0， ImM EDTA， 250mM NaCl， 1% SDS。
4. 按照权利要求l所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于步骤(3)中所述的交 替冻融是指将离心管在液氮中速冻后迅速转入沸水中煎煮。
5. 按照权利要求4所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于步骤(3)中将装有真 菌菌丝体的离心管中置入液氮速冻中速冻30秒-2分钟然后迅速转入沸水中煮2-10分钟； 优选的，将装有真菌菌丝体的离心管中置入液氮速冻中速冻1分钟然后迅速转入沸水中煮 5分钟。
6. 按照权利要求l所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于步骤(3)中所述的交 替冻融的次数为1-3次，优选为2次。
7. 按照权利要求l所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于步骤(4)中，所述的离 心在0-4t:的低温条件下进行离心，离心转速为8000-16000rpm;优选的，所述的离心在4t: 的低温条件下进行离心，离心转速为12000rpm。
8. 按照权利要求7所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于步骤(4)中第一次离 心的时间为1-3分钟，优选为2分钟；第二次离心的时间为5-15分钟，优选为10分钟。
9. 按照权利要求1所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于步骤(4)中将沉淀风 干之前，加入lml的75X乙醇洗涤沉淀，4t:，12000rpm离心1分钟。
10. 按照权利要求1所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于，所述的真菌包 括侧耳属(Pleurotus)真菌，细极链格孢菌(Alternaria te皿issima)、葡萄座腔菌 (Botryosphaeria dothidea(Moug. )Ces. &De Not.)、尖抱嫌刀菌(Fusariumoxysporum)、 围小丛壳菌(Glomerella cingulata)、果生链核盘菌(Moniliniafructigena Honey)、 盘长 包状剌盘 包菌(Colletotrichum gloeosporioides)、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilaci皿s (Thom. ) Samson)。
全文摘要
本发明公开了一种用于PCR扩增的真菌DNA快速提取方法，包括以下步骤(1)培养真菌，得到真菌菌丝体；(2)将真菌菌丝体置于装有裂解液的离心管中；(3)将离心管交替冻融；(4)离心，取上清，加入95％乙醇，混匀，液氮速冻，离心，弃上清，将沉淀风干，即得。本发明方法操作简单，省时省力且减少了研磨过程中真菌DNA的损失，无需用苯酚和氯仿抽提，避免了有毒试剂的接触。本发明方法所提取DNA完整性好，纯度高，收率高，可直接用于PCR扩增反应，能够高效扩增出用于克隆和测序的目的产物。本发明方法提高了真菌DNA的提取效率，降低了真菌DNA提取的成本，可有效提高真菌的分子鉴定和检测效率。
文档编号C12R1/77GK101696411SQ20091023559
公开日2010年4月21日 申请日期2009年9月29日 优先权日2009年9月29日
发明者朴春根, 李永, 林彩丽, 汪来法, 王曦茁, 田国忠, 郭民伟 申请人:中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所;