专利名称：Nedd4l基因多态位点在制备预测双氢克尿噻疗效试剂盒中的用途及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及vV￡Z)Z)4iL基因多态位点的一种新用途，具体地说是在制备利尿剂预测 双氢克尿噻疗效试剂盒方面的用途，属于医学分子生物学领域。
背景技术：
高血压是冠心病、脑中风等众多心血管疾病的最大的独立危险因素。近年来，高 血压的患病率逐年上升，在世界范围内，2000年全世界有9.72亿高血压患者，到2025 年有可能达到15.6亿。在中国，高血压患病率18.8%，高血压患者约有1.6亿，并 以每年350万新病例的速度递增。积极干预血压，通过治疗控制高血压可以有效降低 脑中风与心脏病的发病与死亡，这已是非常肯定而且被广泛接受的事实。研究证实收 缩压降低10—12mmHg和舒张压降低5 —6mmHg可使脑中风发病危险减少40X，冠 心病发病危险减少16%，总死亡率减少20%。血压越高，降低血压带来的益处越大。 单药治疗在非选择高血压人群的有效率为50%左右，六大类抗高血压药物已被临床试 验证实均可作为一线治疗药物。
噻嗪类利尿药无论单用或与其它药物联用，都是一类应用非常广泛且有很好疗效 的药物。双氢克尿噻(hydrochlorothiazide, HCTZ)是心血管疾病中应用非常广泛的噻嗪 类利尿药，也是治疗原发性高血压的一线用药。近年來国内外大规模随机、双盲临床 试验证明，双氢克尿噻不但降低患者血压，而且减少脑卒中、冠心病的发病率和由心 血管疾病引起的死亡率。我国现阶段仍然为发展中国家，而目前市场上常用降压药物 大多数为每片2-8元，对于工薪阶层和农民过于昂贵，直接导致高血压病患者中80% — 90%的低收入患者因负担不起药费而放弃长期治疗，造成高血压控制率低下，而脑中 风、冠心病等心脑血管疾病高发。
利尿剂，尤其是噻嗪类利尿剂双氢克尿噻每年仅需人民币ll元，是目前市场上最 为便宜的降压药物，也是最适合中国国情的降压药。虽然双氢克尿噻降压疗效显著， 但也有研究发现，无论是在降低血压，减少临床事件，还是在出现不良反应方面，不 同个体之间存在着显著差异。这种差异是由多种因素，如环境因素、年龄、性别、体 重和治疗前血压等造成，越来越多的研究发现基因变异可以导致不同的病人对药物有 不同的治疗反应，相关通路上的基因变异可解释20%-95%的药物反应个体差异，找出这些差异，不但可以指导安全有效的用药，而且具有极大的经济学价值。
发明内容
本发明的发明目的是提供W￡￡>D"多态性位点rs4149601的新用途，为用于制备 准确预测利尿剂双氢克尿噻疗效试剂盒中的用途。
本发明的再一目的在于提供一种可以准确预测利尿剂双氢克尿噻疗效的检测试 剂盒。
本发明的第三目的在于提供用于检测A^DD"多态性位点rs4149601的特异性引物。
本发明的发明思路为ENaC-NEDD4L-SGKl通路在机体水钠代谢方面发挥重要 作用。ENaC位于终末肾单位的细胞顶膜上，为钠离子重吸收的关键限速位置。NEDD4L 的WW域与ENaC的PY域结合，使ENaC泛素化，从细胞膜进入溶酶体被降解。如果 NEDD4L发生变异，使其与ENaC的结合受到影响，会导致ENaC不能正常的进入溶酶 体被降解，而是在细胞膜上持续表达，从而引起钠离子重吸收增加。C2域是NEDD4L 的一个重要结构域，对于NEDD4L向细胞膜处转运有重要作用，因此C2域的有无对 ENaC的活性影响很大。
A^DD"基因外显子1末端的变异，可以引起基因剪切点的改变，导致C2域的结 构截短及功能改变。我们认为A^Z)D"可对钠离子的重吸收产生影响，但其与利尿剂 双氢克尿噻治疗效果之间有无直接影响，带着这个疑问，发明人作了进一歩的研究。
发明人以A^DD"基因为功能候选基因，在河南省信阳市农村社区原发性高血压 人群中研究了 vV￡Z)Z)"的基因变异对利尿剂双氢克尿噻疗效的影响。发现一个位于 iVEDZM丄基因外显子1的基因变异rs4149601在高血压病人群中与双氢克尿噻的疗效 紧密相关。据此制备了预测试剂盒，并在河南信阳的高血压人群进行检测，发现该试 剂盒确能有效预测双氢克尿噻的降压疗效。
本发明采用的具体技术方案为
NEDD4L基因多态性位点在制备预测双氢克尿噻疗效试剂盒中的用途。 上述用途，其中所述NEDD4L基因多态性位点为SNPrs4149601，所述rs4149601 位点为A或G。
用于准确预测双氢克尿噻疗效的检测试剂盒，其中，所述试剂盒由下述试剂组成
成分和含量如下50人份，于一2(TC保存； 250^L 2xTaqMIX;各15(iL (10umoV L) SEQ IDNO.l禾卩SEQ IDN0.2所示引物； lml去离子双蒸水；
lOOpL 10xKpnl限制性内切酶反应缓冲液； 10|_iL BSA;
12.5fiL 10UVL限制性内切酶Kpnl。 用于预测双氢克尿噻疗效的检测引物，序列如SEQ ID No.l和SEQ ID No.2所示。
试剂盒推荐使用方法
(1) 使用DNA纯化试剂盒从外周血中提取基因组DNA，所有歩骤均按照说明
书进行。
(2) 使用预测双氢克尿噻降压疗效的试剂盒对rs4149601进行基因分型。 本发明的优点和效益在于
1. 本发明首次在高血压病人群中将W￡Z)Z)"基因多态和利尿剂双氢克尿噻的疗 效紧密关联在一起，本发明揭示了其最根本的原因是由于A^Z)Z^i:rs4149601的改变 增加了利尿剂的疗效，确认了在高血压病人群中ATDZ)"基因多态对双氢克尿噻降压 疗效具有预测作用。
2. 本发明A^Z)Z)"基因多态位点在高血压病中对双氢克尿噻降压疗效的预测效
果非常准确。
3. 本发明所述的检测检测试剂盒检测快捷、准确，其结果可以为高血压患者提供 有效的预测数据，方便医生针对不同患者选择个体化诊疗方案。
4. 本发明提供的预测双氢克尿噻降压疗效的引物序列(SEQ ID NO.l和SEQ ID N0.2)，扩增出的条带单一纯净特异性好，且成本低廉。
本发明的重要意义高血压病是所有心脑血管疾病发生的最重要的独立危险因 素，也是一个可以控制的因素。在高血压病中yV￡Z5D"的基因多态性对双氢克尿噻降 压疗效方面有良好的预测性，这一基因型分析将会成为指导应用双氢克尿噻治疗的主 要指标，为高血压病患者实现真正意义上的个体化用药提供了指导。本发明检测成本 低廉，易被广大患者所接受，实现普査为医生提供准确的治疗信息以便选择具体的治 疗方案。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步说明，并非对本发明的限制，凡 是依照本发明公丌内容所做出的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
图1为SNPrs4149601 (G/A)位点的分型图谱，M为核酸标准品。
具体实施方式
实施例1
一、 临床试验从河南信阳的三个县入选了无相关的从未接受过任何高血压药物治疗
或者在最近l月内没有接受过药物治疗的40-75岁高血压病人(人群l)。高血压诊断 标准为2月内三次不同时间检査收縮压^140mmHg和/或舒张压^90 mmHg。调査流程 包括①问巻调査基本情况和病史、吸烟和饮酒等传统危险因素情况，②测量双上肢坐 位血压，③抽空腹静脉血样， 留取尿样，⑤测量身高、体重、腰围、臀围，⑥内科 听诊和物理检查，⑦12导心电图检査，⑧超声心动图检查，(D根据随机号发药，并注 明下次随访时间和注意事项。每一名调査对象都由经过培训并考核合格的调査者应用 标准水银柱血压计根据美国心脏协会推荐的方案测量3次血压，并根据调查对象的右 上臂围选择适当的袖带(成人号、大号、特大号)。血压测量前30min，调査对象不能饮 酒、吸烟、饮咖啡/茶或进行较为剧烈的活动，休息至少5min后坐位测量血压。取3 次血压平均值作为基线血压值。入选者的收縮压5l80mmHg和舒张压^110mmHg， 一 般情况良好，排除继发性高血压、心肌病、瓣膜疾病、先天性心脏病、糖尿病、痛风、 对双氢克尿噻过敏及肝肾功能不全者，所有参与者均不能服用其它降压药及与双氢克 尿噻有相互作用的药物，所有入选患者给予双氢克尿噻12.5mg/次， 一天两次口服。 在2周后测量血压并记录用药副作用，凡血压不达标或有用药副作用的患者停止该实 验。入选患者可以无条件退出试验，4周后共135例符合条件的患者进行分析。
生化指标取尿和空腹12小时静脉血，检测相关的生化指标。糖尿病为空腹血糖 27.Ommol/L，或有糖尿病病史者。体重指数(BMI):体重(kg)/身高(m)2。"曾经吸烟 "定义为有生以來吸烟多于20包，或者持续一年每天吸烟至少一支；"曾经饮酒"定
义为饮酒持续一年，平均每周至少一次。
二. 基因分型
1试剂
(1) 人血基因组DNA纯化试剂盒DP318-02 (天根生化科技，北京，中国)
(2) 10%SDS: lO.Og SDS溶于卯mL水中，调pH7.2，加水定容至100mL 。
(3) TE: 10mM Tris-HCl (pH 8.0), lmM EDTA-Na2 (pH 8.0)
(4) 50xTAE电泳缓冲液242.0g Tris-HCl， 27.5mL冰乙酸，100mL 0.5mM EDTA-Na2，终体积1L。(5) 限制性内切酶均购自美国New England Biolabs公司
(6) 所有引物均购自北京奥科生物公司 2仪器及设备
(1) PCR仪DNA engine美国Bio-Rad公司
(2) 冷冻离心机RC-5C美国SORVALL公司
(3) 天平JA5003上海天平仪器厂
(4) 凝胶电泳槽北京六一仪器厂 3实验歩骤
(1) 使用血基因组DNA纯化试剂盒(DP318-02)从4ml外周血中提取基因组 DNA，所有歩骤均按照说明书进行。
(2) 聚合酶链式反应一限制性内切酶长度多态性(PCR-PFLP)法对rs4149601 进行基因分型，具体如下
A. PCR扩增目的片段
PCR扩增的引物、退火温度(Tm)及产物长度见表l。
表1 NEDD4L基因多态位点PCR具体信息
基闪变异引物(5'-3')PCR产物 (bp)退火 (°C)内切酶
Rs4149601F: 5' CCAAGCAAAGTCTTACCGAGTGGTAC 3' R: 5' CCGTGTAGACTGCTTTCCTGGG 3'23260Kpnl
使用PCR反应系统(KT221-01，北京天根生化科技)进行扩增， 体系如下
Taq Mix(2X) 5.0uL gDNA (100ng/uL) 1.5uL PF (5pmol/uL) 0.3uL PR (5pmol/uL) 0.3uL ddH20_2.9uL
total PCR反应条件
step 1=94.0°C5分钟
10.0uLstep 2=94.0°C step 3=60.0°C
30秒
30秒
重复30个循环
step 4=72.0°C 18秒 J step 5=72.0°C 7分钟 step 6=4.0°C
B.酶切
将PCR产物酶切12小时，其反应体系如下 PCR产物 10.0 uL
10X Buffer 1 2 uL
BSA 0.2uL Kpn I 2.5 unit
ddH2Q_补齐到20uL
C.电泳鉴定(参见图1)
rs4149601: PCR产物长232bp， Kpnl酶切后，4%琼脂糖胶电泳检测，GG基因 型者可见210bp—条片段，GA基因型者可见232bp、 210bp二条片段，AA基因型者 可见一条232bp片段；
三. 统计学分析
计量资料符合正态分布以均数±标准差表示。计量资料组间比较采用t检验或单 因素方差分析(ANOVA)。计数资料、基因型和等位基因频率比较、以及Hardy-Weinberg平衡检验均采用卡方检验(％2)。采用线型回归模型分析基因型与药物降 压疗效的相关性，并调整年龄、性别、体重指数及空腹血糖。以PO.05为有统计学 显著性差异。釆用SPSS13.0软件包进行统计处理。
四. 结果
1.研究人群的临床特点-
本研究入选高血压人群的临床特点如表2所示。
总体积
20.0 uL
表2人群1的基础临床资料
临床指征
人数
性别，男/女
38/97年龄，岁56.15±8.95
BMI, kg/m226.06±3.33
收縮压，mmHg159.81±17.70
舒张压，mmHg98.20±9.54
HDL-C, mmol/L1.58±0.32
LDL-C, mmol/L3.11±0.87
TC, mmol/L5.51±1.06
空腹血糖，mmol/L5.39±1.34
吸烟，％15.6
饮酒，％20.7
BM1，体巫指数；HDL-C,高密度胎蛋白胆l古l醇；LDL-C，低密度脂蛋A胆I司醇；TC， 总胆|古|醇年龄，体亚指数、收縮压、舒张压、高密度脂蛋白胆同醇、低密度脂蛋白胆岡醇、 总MH向醇、空股血糖以均数土标准差表示；其它指标是以百分数表示。 2.在高血压病患者中ATDD"基因多态位点与双氢克尿噻降压疗效的相关性 所选A^DD"基因rs4149601的等位基因频率符合Hardy-Weinberg。 在高血压病患者中，我们发现A^DD礼基因rs4149601位点与双氢克尿噻的降压 疗效存在显著相关性(表3) 。 Rs4149601 A等位基因携带者在应用双氢克尿噻后收 缩压和舒张压降低程度明显高于GG基因型者。采用线型回归模型，在校正了性别、 年龄、体重指数、空腹血糖后发现A^DD"基因rs4149601与双氢克尿噻降低收縮压 (尸=0.046)和舒张压(尸=0.008)存在显著相关性，A等位基因携带者比GG基因型 者收縮压和舒张压各多降6.84mmHg禾H 3.90mmHg。
_表3人群1中A^J3Z)4基因多态性与双氢克尿噻降压疗效的相关性_
基因变异 血压 _降压疗效(mmHg)_ _
AA+AG(n=54) GG(n=8 P值 校正后P值
_^_
Rs414%01 收缩压 24.58±21.34 17.74±18.16 0.048 0.046 _舒张压_12.55士10.06 8.65±10.85_0.037 0扁
尸值是采W线型冋归模型，在校正了相应的基础血压值后的结果；校正的P值采用线型回归 模荆，在校止了性别、年龄、体重指数、空腹血糖后的结果。 五.结论A^DD"基因rs4149601 A等位基因携带者对双氢克尿噻降低收缩压和舒张压的 程度明显高于GG基因型者。本发明首次将A^DZ)"的基因多态性与双氢克尿噻疗效 单独联系起来，为实现真正意义上的个体化用药提供科学依据。 实施例2:预测双氢克尿噻降压疗效的试剂盒
一. 组成成分和含量如下(50人份)，于一2(TC保存
250fiL 2xTaqMIX(TaKaRa)
各15pL(10umol/L)SEQIDNO.1和SEQ ID NO.2引物(北京奥科生物公司) lml去离子双蒸水(ddH20)
lOOpL 10xKpnl限制性内切酶反应缓冲液(美国New England Biolabs公司) lO(aL BSA(美国New England Biolabs公司)
12.5^L(10U4iL)限制性内切酶Kpn I (美国New England Biolabs公司)
二. 使用方法
1. 常规方法提取受试者基因组DNA;
2. PCR反应
表4
反应组分贮存液浓度体积(uL)终浓度
基因组DNA100ng/uL1.510ng
上游引物(SEQ ID NO.l)lOumol/L0.30.3umol/L
下游引物(SEQ ID NO.2)lOumol/L0.30.3umol/L
TaqMIX2x5.0lx
去离子双蒸水(ddH20)2.9
总体积(total volume)10.0
Taq Mix(2X)5.0uL
gDNA (100ng/uL)1.5uL
PF (5pmol/uL)0.3uL
PR (5pmo亂)0.3uL
d恥O2,9uL
totallO.OuL
反应条件.-step 1=94.0°C
5分钟
step 2=94.0°C
30秒
st印3=60,0°C
30秒
重复30个循环
step 4=72.0°C 18秒 step 5=72.0°C 7分钟 step 6=4.0°C
3. 酶切
将PCR产物酶切12小时，其反应体系如下 PCR产物 10.0 uL
10X Buffer 1 2 uL
BSA 0.2uL Kpn I 2.5 unit
ddH20_补齐到20uL
总体积 20.0 uL
4. 电泳鉴定
rs414960h PCR产物长232bp, Kpnl酶切后，4%琼脂糖胶电泳检测，GG基因 型者可见210bp—条片段，GA基因型者可见232bp、 210bp二条片段，AA基因型者 可见一条232bp片段；
实施例3:在河南信阳另两个县的高血压病人群(人群2)中检测上述试剂盒对利尿剂
双氢克尿噻疗效的预测作用。
实施方案
一. 为了进一歩验证该试剂盒对双氢克尿噻降压疗效的预测作用，在河南信阳按实施
例1完全相同的检查及标准入选125例患者，给予双氢克尿噻12.5mg/次， 一天两次， 共治疗4周。
二. 基因分型
1. 所用试剂及仪器设备与实施例1完全一致。
2. 实验歩骤
(1) 使用血基因组DNA纯化试剂盒(DP318-02)从4ml外周血中提取基因组 DNA，所有步骤均按照说明书进行。
(2) 使用预测双氢克尿噻降压疗效的试剂盒对rs4149601进行基因分型，具体按试剂盒说明书操作。 三.结果
1.研究人群的临床特点
本研究入选高血压人群的临床特点如表5所示。
表5人群2的基础临床资料
临床指征人数125
性别，男/女45/80
年龄，岁57.27±7.97
BMI, kg/m225.60±3.40
收縮压，mmHg161.73±18.87
舒张压，mmHg96.06±11.98
HDL-C, mmol/L1.50士0.37
LDL-C， mmol/L3.02±0.82
TC, mmol/L5.50±1.06
空腹血糖，mmol/L5.50±1.50
吸烟，％23.2
饮酒，％20.8
BMI,体2:指数HDL-C,高密度胎蛋fi胆l古l醇；LDL-C，低密度脂蛋白胆l古l醇TC, 总)J曰问醇年龄、体重指数、收缩压、舒张压、高密度脂蛋白胆同醇、低密度脂蛋白胆固醇、 总胆问醇、仝股血糖以均数±标准差表示；其它指标是以百分数表示。 2.在高血压病患者中iVEZ)D礼基因多态位点与双氢克尿噻疗效的相关性 所选A^Z)ZM丄基因变异的等位基因频率符合Hardy-Weinberg。
在高血压病患者中，我们发现rs4149601位点与双氢克尿噻降低患者收缩压和舒张 压存在显著相关性(表6)，校正了性别、年龄、体重指数、空腹血糖后发仍与双氢 克尿噻降低平均压(尸=0.037)和收縮压(P-0.039)存在显著相关性，A等位基因携 带者比GG基因型者收縮压和舒张压各多降7.83mmHg和4.02mmHg。
_表6人群2中A^Z)D礼基因多态性与双氢克尿噻疗效的相关性_
基因变异 血压 _降压疗效(mmHg)_ _
AA+AG GG P值 校正后P值Rs4M9601 收缩压 26.14士21.32 18.31±19.60 0.037 0.037 _舒张压 1Q.94土10.88 6.92士10.79_0.044 0.039
尸值是采用线朋冋归投M，在校止了相应的基础血压值后的结果；校正的尸值采用线型冋
Pn投型，在校止了性别、年龄、体重指数、腰兩、腰臀比及相应的基础血压值后的结果。
五.结论
使用预测双氢克尿噻降压疗效的试剂盒对rs4149601进行基因分型后对双氢克尿 噻降压疗效具有显著预测作用，预测效果准确，根据该预测结果，医生可以有效的针 对不同患者选择其个性治疗方案，进而有益于治疗效果的提升。序列表
<110> 阜外心血管病医院
<120〉 A^DD"基因多态位点在制备预测利尿剂双氢克尿噻疗效试剂盒中的用途及 试剂盒
<130> <160> 2
< 170〉 Patentln version 3.3
<210> 1
<211〉 26
<212> DNA
<213〉 人工合成
<400> 1
CCAAGCAAAGTCTTACCGAGTGGTAC 26
<210〉 2
<211〉 22
<212〉 DNA
<213〉 人工合成
<400> 2
CCGTGTAGACTGCTTTCCTGGG 2权利要求
1.NEDD4L基因多态性位点在制备预测利尿剂双氢克尿噻疗效试剂盒中的用途。
2. 根据权利要求1所述的NEDD4L基因多态性位点在制备预测利尿剂双氢克尿 噻疗效试剂盒中的用途，其特征在于，所述NEDD4L基因多态性位点为SNP rs4149601。
3. 根据权利要求2所述的NEDD4L基因多态性位点在制备预测利尿剂双氢克尿 噻疗效试剂盒中的用途，其特征在于，所述rs4149601位点为A或G。
4. 用于预测利尿剂双氢克尿噻疗效的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由 下述试剂组成成分和含量如下50人份，于一20'C保存；250|aL 2xTaqMIX;各15pL (10umo1/ L) SEQ IDNO.l禾0 SEQ IDN0.2所示引物；lml去离子双蒸水；lOO(iL 10xKpnl限制性内切酶反应缓冲液； 10pLBSA;12.5nL10U"L限制性内切酶KpnI。
5. 用于预测利尿剂双氢克尿噻疗效的检测引物，其特征在于，所述引物序列如 SEQ ID No.l禾卩SEQ ID No.2所示。
全文摘要
本发明公开了一种NEDD4L基因多态性位点在制备预测利尿剂双氢克尿噻疗效试剂盒中的用途及检测试剂盒，属于医学分子生物学领域。另外本发明还提供了用于预测双氢克尿噻疗效的检测引物，该引物具有高灵敏性和特异性。本发明的意义在于高血压病是所有心脑血管疾病发生的最重要的独立危险因素，也是一个可以控制的因素。在高血压病中NEDD4L的基因多态性对双氢克尿噻降压疗效方面有良好的预测性，这一基因型分析将会成为指导应用双氢克尿噻治疗的主要指标，为高血压病患者实现真正意义上的个体化用药提供了指导。本发明检测成本低廉，易被广大患者所接受，实现普查为医生提供准确的治疗信息以便选择具体的治疗方案。
文档编号C12Q1/68GK101665837SQ20091023520
公开日2010年3月10日 申请日期2009年9月27日 优先权日2009年9月27日
发明者周宪梁, 凯 孙, 张禅那, 惠汝太, 汪一波, 王晓建, 芳 罗 申请人:中国医学科学院阜外心血管病医院