猪基因多态性及其与母猪繁殖性状关联性的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种基因多态性及其与繁殖性状关联性的测定方法，尤其设及一种猪 基因多态性及其与母猪繁殖性状关联性的测定方法。
【背景技术】 阳〇〇引在现在的养猪产业中，我们国家种猪育种往往会陷入一个怪圈，即"引种-退 化-再引种-再退化"，吴常信院±认为产生运种怪圈现象的原因有两个方面，一方面是在 种猪引种的同时已落后，别的国家不会把最好的猪给我们；二是种猪引进后选育的提高效 果没有国外好。为了走出运种怪圈现象，行业内公认的较为可行的方案是：在引种的同时， 应该运用有效地育种手段，对母猪的繁殖性状进行改良，保持母猪群体的高繁殖率。目前， 我国常用的育种方法有两种：传统育种和分子育种。传统育种方法主要是指W数量遗传学 为理论依据的"数量遗传学方法"。繁殖力是数量性状，其受遗传因素的影响较小，遗传力估 值为0. 1~0. 2。所W，采用传统的育种方法，对提高母猪的繁殖性能的作用很小，并且耗时 费钱。随着分子生物学的发展，人们已经开始从分子方面来寻找提高母猪繁殖性能的育种 方法，并且取得了很好的成果。
[0003] 随着分子生物学的快速发展，越来越多的学者开始关注如何在分子水平上来提高 母猪的繁殖性能，并且经过研究，发现了一些与繁殖性能相关的主效基因和有重要作用的 候选基因，例如：催乳素受体基因（P化时、促卵泡素β亚基基因（F甜0)、视黄醇结合蛋白 4基因（RBP4)、雌激素受体基因巧SR)、骨形成发生蛋白7基因度ΜΡ7)。可W看出，与繁殖 性能相关的基因不仅仅局限于与生殖激素相关的基因，还有一些与生长因子相关的基因， 也影响着母猪的繁殖性能。Harvey等研究发现，有些生长因子在母猪的生殖过程中参与早 期胚胎的发育和成熟，RBP4基因和BMP7基因就是与生长因子相关的基因。RBP4基因是体 内一种重要的转运蛋白，它的主要功能是结合并转运维生素A及其衍生物，它们都是体内 非常重要的物质，尤其是维生素A，它对于人和动物都是不可或缺的，它可W促进精子和卵 子产生、胎盘发育、胎儿生长与发育，也可提高胚胎直径的整齐度和胚胎发育的同步性，从 而降低早期胚胎的死亡率，也可提高仔猪初生均匀度。维生素A还能够调节血液内孕酬的 含量，从而影响母猪的繁殖性能。维生素A还具有维持视力和上皮细胞完整性、促进生长发 育、增强机体抗病能力，对母猪繁殖性能可产生有益作用。如果人或动物体内的RBP4出现 了问题，将会对人或动物机体产生严重的影响，首先RBP4故障会引起维生素A的储存、转 运、分布及代谢的异常，其次会引发各种疾病，并影响上皮、骨组织的生长、分化与繁殖、胚 胎发育。
[0004] 骨形态发生蛋白7度MP7)是转化生长因子-MTGF-β)超家族中的一员，研究发 现，BMP7能够促进造骨细胞的分化和诱导异位骨的的形成，还参与许多器官的发育和形成， 在许多肾、肾上腺、骨、膀脫和脑组织W及骨肉瘤细胞中都有表达，在许多肾脏疾病模型中， 能有效阻止肾小管间隙纤维化来保护肾脏的功能，此外，BMP7能够促进生殖系统的生长和 发育，影响动物的繁殖性能。研究表明：在雌性动物的垂体、卵巢和子宫内都发现有BMP7基 因的表达。BMP7可W促进垂体内激素的形成和释放，也可W促进卵巢和子宫的发育和成熟， 不仅如此，BMP7还可W促进卵泡的发生和成熟，促进黄体形成、类固醇的合成W及精子的发 生和成熟。
[0005] 目前，对猪RBP4和BMP7基因的研究越来越多，但大部分研究对象都集中在外来品 种猪，特别是大白猪和长白猪。相关试验已经证明RBP4和BMP7基因与长白猪和大白猪繁 殖性能具有一定的相关性，但RBP4和BMP7基因在安徽本地猪种上的研究近乎是空白。
[0006] 本发明所述研究W安徽省两个本地品种（晓南黑猪及霍寿黑猪）和两个外来品种 大白猪、长白猪为试验对象，检测在该四个群体中RBP4和BMP7基因的遗传变异。通过调 取、统计分析该四个猪种群体能繁母猪繁殖性状指标数据，并进行基因型间的关联性分析， 探讨RBP4和BMP7基因多态性对不同猪群能繁母猪繁殖性状指标的遗传效应，且可W外来 品种猪作为对照，来探讨利用运两个基因作为分子标记改良安徽地方母猪繁殖性能的可行 性。旨在掲示RBP4和BMP7基因与猪繁殖性能的关系，为猪繁殖性状的育种改良寻找简洁 高效的途径，为安徽地方猪种的保种、选育提供理论依据，并为其开展配套系的培育积累素 材。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种操作简便、结果可靠的猪基因多态性及其与母猪繁殖性状关联 性的测定方法。
[0008] 一种猪基因多态性及其与母猪繁殖性状关联性的测定方法，包括如下步骤：
[0009] (1)采集成年能繁母猪耳组织样品；
[0010] 似耳样组织DNA提取；
[0011] (3)PCR扩增视黄醇结合蛋白即RBP4、骨形态发生蛋白即BMP7基因目的片段；
[0012] (4)目的片段单链构象多态性即SSCP分析； 阳01引 巧)PCR扩增产物双向测序；
[0014] (6)群体遗传学特性分析； 阳〇1引 （7)ii定繁殖性能；
[0016] 做采用数学模型分析所检测到的RBP4、BMP7基因的遗传变异与母猪繁殖性状指 标的关联性。
[0017] 根据目的基因单核巧酸多态性即singlenucleotidepolymo;rphism:SNP与母猪 繁殖性状指标的关联性分析，探讨所检测到的SNP位点对不同猪群母猪繁殖性状指标是否 有影响，从而判定所检测到的SNP位点能否作为母猪繁殖性状育种的有效标记位点。
[0018] 本发明所述猪基因多态性及其与母猪繁殖性状关联性的测定方法，其中，所述步 骤（1)具体包括如下步骤：
[0019] 耳样组织采集对象为成年能繁母猪，其中长白猪106头、大白猪100头、晓南黑猪 74头及霍寿黑猪59头。其中霍寿黑猪采自霍邱安徽浩宇牧业有限公司，晓南黑猪采自绩溪 安徽丰润生态农业开发有限公司，长白猪、大白猪采自肥东安泰农业开发有限公司。
[0020] 提前在1. 5血的化pendo计管中注入70%体积分数浓度的酒精，然后每头母猪采 耳组织块Ig，装入所述化pendo计管中，于-20°C保存备用。
[0021] 本发明所述猪基因多态性及其与母猪繁殖性状关联性的测定方法，其中，所述步 骤（2)具体包括如下步骤：
[0022] 耳样组织DNA提取过程为：①用眼科剪剪取0. 2g耳组织，去除其表面毛发及酒精， 装入1. 5血邱pendorf管中，并尽可能将耳组织剪碎；②DNA的提取采用北京全式金生物 科技有限公司的组织DNA提取试剂盒提取；③将得到的DNA调终浓度至l(K)ng/μL放在 2-8摄氏度保存；④DM纯度检测：取1 μLDM在SMA1000上测定0D260/0D280的比值， 当0D260/0D280比值在1. 8-2. 0之间说明所提DNA纯度较高；⑥质量检测：将所提DNA用 1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，观察提取产物的质量W便进行后续实验。
[0023] 本发明所述猪基因多态性及其与母猪繁殖性状关联性的测定方法，其中，所述步 骤（3)具体包括如下步骤： W24] ①W步骤似获得的耳组织样DNA为模板，根据GenBank猪RBP4基因外显子1、 5、6及内含子3序列，其登录号为NC_010456. 4,采用PrimerPremier5.0软件设计4对引 物，进行RBP4基因部分序列的克隆，并采用2%琼脂糖凝胶电泳检测克隆产物是否为目的 片段；其中引物RBP4exonl、5、6及内含子3的核巧酸序列如序列表中SEQIDN0:1和SEQ IDNO:2、沈QIDNO:3和沈QIDNO:4、沈QIDNO:5和沈QIDNO:6及沈QIDNO:7和 SEQIDNO:8所示，退火溫度及目的片段长度见表1 ; W25] ②W步骤似获得的耳组织样DNA为模板，根据GenBank猪BMP7基因外显子2、 3、7及内含子2序列，其登录号为NC_010459. 4,采用PrimerPremier5.0软件设计4对引 物，进行BMP7基因部分序列的克隆，并采用2%琼脂糖凝胶电泳检测克隆产物是否为目的 片段；其中引物BMP7exon2、3、7及内含子2的核巧酸序列如序列表中SEQIDN0:9和SEQ IDNO: 10、沈QIDNO: 11和沈QIDNO: 12、沈QIDNO: 13和沈QIDNO: 14及沈QIDNO: 15 和SEQIDNO: 16所示，退火溫度及目的片段长度见表2 ;
[00%] ③按照PCR扩增体系将各种试剂和溶液混匀后放入PCR仪中，在94°C条件下预变 性5min，然后再94°C条件下变性30s，复性30s，退火溫度根据各引物的最佳退火溫度而定， 在72°C条件下延伸30s，30个循环，最后在72°C条件下延伸lOmin，在4°C条件下保存备用；
[0027] 所述PCR扩增反应体系为：2XReactionMix10μLdd&0 8. 32μLDNA Polymerase0. 2μL，Forwardprimer0. 24μL，Reverseprimer0. 24μL，DNAΙμΙ。
[0028]本发明所述猪基因多态性及其与母猪繁殖性状关联性的测定方法，其中，所述步 骤（4)具体包括如下步骤：
[0029] 先将步骤（3)所述各引物对的PCR扩增产物分别进行非变性聚丙締酷胺凝胶电 泳，然后分别进行硝酸银染色后用凝胶成像系统观察电泳结果得到所述猪RBP4、ΒΜΡ7基因 单链构象多态性；
[0030] 其中，所述非变性聚丙締酷胺凝胶电泳具体包括如下步骤：