测定人PON2基因rs7493位点多态性的方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及测定单核巧酸多态性的方法。
【背景技术】
[0002] SNP(单核巧酸多态性）是指单个核巧酸的改变引起的DNA序列变异，包括单碱基 的置换、插入和缺失等形式。基因多态性是个体与生俱来的遗传特征，不随环境发生变化， 也不是某种疾病特异或者非特异的临床表现，因此其应用并不存在诊断和治疗作用。
[0003] 基因多态性检测在遗传学领域和医学领域中应用广泛，举例如下：1.研究物种起 源和进化等遗传学现象。根据基因变异情况，获得生物大分子的信息，推断生物进化历史， 阐明物种进化关系。应用于考古学中W确定古人类遗传变异特征W及不同种群的亲缘关 系。2.研究多态与种群亲缘关系等遗传学研究。多态亦与各种人体特征密切相关，包括身 高、体重、肤色、相貌特征等等。3.在预防医学领域可W用于疾病预防措施。通过研究人体 对毒物的耐受性，发现易于对某种毒物发生毒性作用的个体，及时避免该个体与毒物接触， 保护该易感人群。例如，对准备从事接触苯等有机溶剂的人群进行多态检测，筛查出容易出 现血液毒性、神经毒性等反应的个体，令其远离苯等有机溶剂，保护此类易感人群免受毒物 侵害。4.药理学中可W用于药物选择W及剂量确定。通过多态检测可W判断患病个体对某 种药物毒副作用敏感，从而避免使用此种药物W免除其毒性作用。通过判断个体对药物效 果的反应程度确定药物剂量，减少药物用量及其副作用。
[0004] 对氧憐酶（paraoxonase，P0N)基因家族包括Ξ个成员：P0N1、P0N2和P0N3。其中 P0N2基因位于染色体7q21. 3,其表达产物在体内广泛分布，能水解对氮憐类有机憐化合物 和高密度脂蛋白上的氧化型憐脂。P0N2基因rs7493位点多态，在人群中存在两种等位基 因C和G，形成Ξ种P0N2基因的基因型：CC型（人体基因组rs7493多态位点的两个等位基 因碱基均为C)，CG型（人体基因组rs7493多态位点的两个等位基因碱基分别为C和G)和 GG型（人体基因组rs7493多态位点的两个等位基因碱基均为G)。 阳0化]聚合酶链式反应-限制性片断长度多态（PCR-RFL巧技术是一种快速、简便、准 确、低成本测定SNP(单核巧酸多态性）基因型的经典方法。该方法通过引物来对模板进行 扩增反应，形成足够数量和稳定的扩增产物，通过对扩增产物的酶切和检测酶切产物的片 段长度，最终测定出SNP。现有的应用PCR-RFLP检测P0N2基因rs7493位点基因多态性 的PCR反应条件要求苛刻，可用的限制性内切酶仅有DdeI、化y1881、BspCNI等，需要开发新 的检测技术。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种非疾病诊断或治疗目的用的测定人P0N2基因rs7493位 点多态性的可靠手段。
[0007] 根据本发明的第一方面，提供了一种测定人P0N2基因rs7493位点多态性的方法， 包括：
[0008] 提供待测人基因组DM;
[0009] 提供扩增人P0N2基因rs7493位点附近序列的上游引物和下游引物，其中上游引 物具有错配碱基C;
[0010] W所述待测人基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增反应W 获得含CCATS片段或CATS片段，其中S为人P0N2基因rs7493位点上的待定碱基C或G;
[0011] 提供限制性内切酶；
[0012] 利用限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切（反应）W获得相应的酶切产物；W 及 阳01引根据所得酶切产物来确定人P0N2基因rs7493位点上的待定碱基S是C还是G，其 中，限制性内切酶为能够切开CCATC与CCATG片段或CATC片段与CATG片段之一限制性内 切酶。
[0014] 根据本发明的实施例，在所得扩增产物上，上游引物的错配碱基C与S之间相隔两 个碱基AT。令人惊讶的是，如此设置错配碱基将使酶切反应进行得极其顺利，不会出现酶切 不充分等现象。并且，如此设置上游引物错配碱基使PCR反应进行顺利，提高了PCR的灵敏 度和特异度，运可能与错配碱基后使得扩增序列的二级结构改变有关。
[0015] 在本发明的一个可选实施例中，在所得扩增产物上，上游引物末端碱基与S相邻。
[0016] 在本发明的一个优选实施例中，在所得扩增产物上，上游引物末端碱基不与S相 邻。例如，上游引物末端可W是……CA结构。难W想象，具有运种设计的上游引物竟然会 进一步大大促进酶切反应，运可能与扩增结合力有某种关联。
[0017] 在本发明的一个优选实施例中，限制性内切酶可W采用仅能切开CCATC片段的 BccI或其同裂酶。
[0018] 根据本发明的实施例，所得酶切产物包括Ξ种片段类型：具有总片段长度的未切 断扩增产物、切断后具有较长片段的扩增产物W及（通常不能有效观测到的）切断后具有 较短片段的扩增产物。通过观测（判断）酶切产物所包含的片段类型来确定人P0N2基因 rs7493位点上的待定碱基是C还是G。例如，在采用BccI酶的情况下，根据总片段和切断 后较长片段运两个片段的观察结果来进行判断：如果观察到酶切产物只有一种具有总片段 长度的未切断扩增产物，则待定碱基为G;如果观察到酶切产物只有一种具有较长片段（小 于总片段长度）的切断产物，则待定碱基为C;如果观察到上述二者，则待定碱基既包括C 又包括G。
[0019] 在本发明的一个实施例中，判断（或观测）酶切产物所包含的片段类型是通过凝 胶电泳联合紫外灯拍照后与参照图对比来进行的。运种情况下，优选参照图是扩增产物在 凝胶电泳标准设定时间后经紫外灯拍照后而得且仅具有第一参照图像位置和第二参照图 像位置，其中第一参照图像位置针对的是未切断的总片段长度的扩增产物，而第二参照图 像位置则针对的是切断后具有较长片段的扩增产物。例如，本发明采用的参照图是由合成 的128bp和82bp两个碱基片段同时经凝胶电泳相同时间后紫外灯拍照而成。与常规DNA ladder的复合参照图相比，由于采用了仅具有两个特定参照图像位置的参照图，本发明的 运种方法能够直观快速地观测或判断酶切产物所包含的片段类型，同时最大限度地避免了 误判。酶切反应后优选将酶切产物浓缩1~2倍浓度后进行电泳，增加图像亮度，提高判断 准确性。
[0020] 在本发明的优选实施例中，通过设计上游引物和下游引物的长度而使得扩增产物 的总片段长度在100至300bp之间，并且上游引物的片段长度至少为35bp，优选长度40~ 6化P(在该优选区间扩增反应尤其顺利充分），使得酶切切掉部分片段长度占总片段长度 的百分比超过20%。本发明的运种设计可W使得具有总片段长度的未切断扩增产物与切断 后具有较长片段的扩增产物的电泳紫外照片的位置区别显著。但是，如果总片段过长，则电 泳位移将不明显；过短则图像会变的模糊一片，无法准确区分。上游引物的片段长度范围保 证了PCR扩增反应能够顺利进行，避免了错配碱基时会出现的扩增不足现象。 阳02U在本发明的优选实施例中，通过控制PCR扩增程序中退火溫度的范围在55~70°C之间，优选溫度60~69°C(该溫度可提高扩增反应的特异性），使得设计的PCR产物纯度 较高。本发明的运种设计可W使得PCR扩增产物条带清楚，无杂带出现，易于电泳识别。但 是，如果溫度过低，则特异条带少且杂带过多，电泳后难W区分判断；如果溫度过高，则影响 PCR扩增效率使得特定扩增产物过少，影响观察效果。
[0022] 在本发明的优选实施例中，通过控制PCR扩增程序中延伸时间的范围在10~60s之间，优选时间15~30s(该时间可提高扩增反应的效率和扩增产物的特异性），使得设计 的PCR反应时间较短，扩增产物纯度较高。本发明的运种设计可W使PCR扩增产物条带清 楚，无杂带出现，易于电泳识别，而且PCR时间较短。但是，如果时间过短，则特异条带不能 完全扩增而使