利用单核酸多型性标记组合鉴别猪只免疫特性的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鉴别猪只免疫特性的方法，特别是涉及一种利用单核酸多型性标 记组合鉴别猪只免疫特性的方法及其于育种上的应用。
【背景技术】
[0002] 猪是目前肉品市场的主要供应来源，而养猪产业目前是台湾W及大陆地区最重要 的产业之一，也是单项农产品中产值最高的产业。然而，大量集中饲养猪只的结果，也面临 仔猪育成率低落、各类猪只疫情等问题。虽然各种猪用药品及疫苗不断推陈出新，但归根究 底，猪只本身免疫力低落是主要关键因素之一。因此，如何选拔出免疫特性较佳的猪种，成 为目前猪种育种的重要课题。
[0003] 传统的猪育种方式，主要是W性能检测的结果配合系谱的记录，作为选拔配种的 依据，由此培育出表现型更佳的子代。前述性能检测的项目可例如背廳厚较低、生长速度 快、饲料利用率高、禍体瘦肉量多、母猪繁殖力和育成率高、抗逆性（或健康状况）佳等。
[0004] 然而，传统育种方式仍存在一些问题。首先，不同批次的猪只，其性能检测的结果 难W被正确比较。其次，中央检测的结果是由抽样检定少数猪只所得，并非全部检定，个体 之间的性能仍存在极大的落差。
[0005] 另外，传统的基因检测虽然有助于猪只单基因性状的选拔，但对于涉及多种免疫 基因的检测，其准确性较不足，且成本过高，非一般养猪业者所能承担。
[0006]目前有关选拔免疫特性较佳的猪只与涉及多种免疫基因的检测，不论研究、检测 技术或分析两者间相关性的分析模式，皆十分阔如。有鉴于此，亟需提供一种适用于鉴别不 同品种猪只间，快速且正确鉴别猪只免疫特性的方法，W改善传统选拔猪只的种种缺点。
【发明内容】
[0007]因此，本发明的一方面是提供一种利用单核酸多型性标记组合鉴别猪只免疫特性 的方法，其分析多品系猪只的多个免疫相关基因与多个单核巧酸多型性（SN巧标记组合的 相关性，建立相关性模式，由此鉴别待测样本的免疫特性。
[0008] 根据本发明的上述方面，提出一种利用单核酸多型性标记组合鉴别猪只免疫特性 的方法。在一实施例中，上述方法可先建立相关性模式，再利用此相关性模式鉴别待测样本 的免疫特性。
[0009] 在上述实施例中，建立相关性模式的步骤可包含分别由多种猪只的多个第一周边 血液细胞，获得多个第一核酸样本；然后，再由前述第一核酸样本获得多个第一单核巧酸多 型性资料；接着，获得上述猪只的多个免疫表型分型资料的步骤，其中免疫表型分型资料定 义多个免疫特性。之后，根据复回归算法，使用前述免疫表型分型数据W及前述第一单核巧 酸多型性数据，建立前述的相关性模式。
[0010] 在一例示中，上述免疫表型分型数据可包括但不限于CD4基因表达量、CD8基因表 达量、CD4/CD8的基因表达比、MHCI基因表达量、MHCII基因表达量、CD80/86的基因表达 比、刺激指数（stimulationindex;SI)、IL2基因第二表达量，W及IL2基因第一表达量与 IL2基因第二表达量的差值。前述IL2基因第一表达量代表未W凝集素刺激所得的基因表 达量，而前述IL2基因第二表达量代表经凝集素刺激所得的另一基因表达量。
[0011] 在另一例示中，上述第一单核巧酸多型性数据包括多个单核巧酸多型性位点、 单核巧酸多型性位点的每一个的多个基因型W及对应的多个第一系数值。前述单核巧 酸多型性位点可包括但不限于IFN-a(-235) (GenBank登录号X57191)、IFN-Y(382) (GenBank登录号X53085)、TNF-a(1219)(GenBank登录号NC-010449)、MCP-1 (273) (GenBank登录号CU928660)、MCP-1 (351)(GenBank登录号CU928660)、MCP-1 (360)(GenBank 登录号CU928660)、MCP-1 (383)(GenBank登录号CU928660)、TLR7 (1633)(GenBank登录 号AB291813)、TLR7 (22996)(GenBank登录号AB291813)、TLR8 巧34)(GenBank登录号 AB291813)、TLR9 巧05)(GenBank登录号CPU915558)W及TLR9 (1186)(GenBank登录号 CPU915558)。上述第一单核巧酸多型性位点的每一个的多个基因型一般可包括两种或Η 种。
[0012] 在又一例示中，前述相关性模式包含多个关系式，W定义前述免疫表型分型数据 之一与前述单核巧酸多型性位点的至少两者的关系式。
[0013] 在前述实施例中，前述鉴别待测样本的免疫特性的步骤包含由待测样本的第二周 边血液细胞获得第二核酸样本，由第二核酸样本获得多个第二单核巧酸多型性资料。上述 第二单核巧酸多型性数据包括多个第二单核巧酸多型性位点、单核巧酸多型性位点的每一 者的多个基因型W及对应的多个第二系数值。
[0014] 之后，将前述第二单核巧酸多型性数据输入前述相关性模式，W判断前述第二单 核巧酸多型性资料是否满足该些关系式之一及其对应的显著性差异值（Ρ)。
[0015] 在一例示中，当前述第二单核巧酸多型性数据与前述关系式的至少之一相符，且 对应的显著性差异值（巧小于0.05时，判断前述待测样本具有上述关系式对应的至少一种 免疫特性。
[0016] 在另一例示中，当前述第二单核巧酸多型性数据与前述关系式的任一种都不相 符，或对应的显著性差异值（巧大于0. 10时，则判断前述待测样本不具有上述关系式对应 的免疫特性。
[0017] 依据本发明一实施例，上述猪只W及待测样本的品系可包括但不限于杜洛克 值uroc)、藍瑞斯(Xan化ace)、高畜黑猪度lackhair)、约克夏（Yorkshire)、Η品种杂交肉 猪（LYD)W及无特定病原（specificpathogen-free)的大白猪（XargeWhite)。
[0018] 依据本发明一实施例，上述细胞增殖率可例如为细胞刺激指数（stimulation index;SI)。
[0019] 依据本发明一实施例，上述免疫相关基因的表达量可包括例如细胞表面抗原阳性 率W及IL2相对浓度。
[0020] 依据本发明一实施例，上述细胞表面抗原阳性率可包括例如CD4抗原阳性率、CD8 抗原阳性率、CD4/CD8的表达比、MHCI抗原阳性率、MHCII抗原阳性率W及CD80/86的表 达比。
[0021] 依据本发明一实施例，上述IL2相对浓度可例如IL2基因第二表达量W及IL2基 因第二表达量与IL2基因第一表达量与之差值，其中IL2基因第一表达量代表未W凝集素 刺激所得的基因表达量，而IL2基因第二表达量代表经该凝集素刺激所得的另一基因表达 量。
[0022] 依据本发明一实施例，上述第一周边血液细胞W及第二周边血液细胞可例如为周 边血液单核细胞。
[0023] 依据本发明一实施例，上述由第一核酸样本获得多个第一单核巧酸多型性数据， 更可包含利用扩增受阻突变系统聚合酶链反应（amplificationre化actcxrymutation systempolymerasechainreaction;ARMS-PCR)，扩增上述猪只的第一核酸样本W及第二 核酸样本中具有单核巧酸多型性位点的多个核酸片段。在一例示中，前述ARMS-PCR可利用 如沈QIDNO. ;1-6、14-16、28-30、33-38、66-68、72-74、90-92、99-100、104-106所示的引物 进行。
[0024] 依据本发明一实施例，上述单核巧酸多型性位点的基因型可包括两种或Η种。
[0025]应用本发明的利用单核酸多型性标记组合鉴别猪只免疫特性的方法，其分析多品 系猪只的多个免疫相关基因与多个单核巧酸多型性（SN巧标记组合的相关性，建立相关性 模式，由此鉴别待测样本的免疫特性，可应用在多品系猪只中，选育出具有所需免疫特性的 亲代，或预测其子代的免疫特性。
【附图说明】
[0026] 为使本发明的上述和其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，对附图详细说 明如下：
[0027]图1绘示根据本发明一实施例的利用单核酸多型性标记组合鉴别猪只免疫特性 的方法的部分流程图。
[0028] 图2Α至图10D分别示出根据本发明一实施例的猪周边血液单核细胞的基因组 DNA，利用不同SNP引物进行PCR后，各基因PCR产物片段的电泳照片图，其中各基因PCR产 物片段分述如下：
[0029]IFN-α(-235)(图 2Α)、IFN-Υ(382)(图 2Β)、IFN-Υ(490)图 2C;
[0030]TNF-α(366)(图 3Α)、TNF-α(75W(图 3Β)、TNF-α(1219)(图 3C);
[0031]GM-CSF(193)(图 4Α)、GM-CSF(245)(图 4Β)、GM-CSF(741)(图 4C)、GM-CSF(753) (图 4D)、GM-CSF(782)(图 4E);
[0032]MCP-1 (273)(图 5A)、MCP-1 (336)(图 5B)、MCP-1 (351)(图 5C)、MCP-1 (360)(图 抓）、MCP-1 (383)(图祀）；
[0033] TLR3巧5)(图6A、图7)、TLR3 (159)(图她）、TLR3 (405)(图6C)、TLR3 (800)(图 抓）；
[0034]TLR7 (-332)(图 8A)、TLR7 化6)(图 8B)、TLR7 (357)(图 8C)、TLR7 (141