专利名称：抑制鸡肌肉生成抑制素基因表达的siRNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抑制鸡肌肉生成抑制素基因表达的siRNA及其应用。
背景技术：
2006年我国禽肉产量1506. 6万吨，仅次于美国，位居世界第二，比1985年增长了 6. 5倍，而同期世界禽肉产量只增长了 1.4倍。据FAO统计，我国肉鸡屠宰量从1990年的 21. 29亿只增加到2006年的76. 95亿只，净增加55. 66亿只。鸡肉产量从1990年的266. 32 万吨增加到2006年的1070. 1万吨，净增加803. 78万吨。目前我国禽肉产量占肉类总量的 18. 7%，人 均占有量1. 5千克，同比世界禽肉产量比例30. 3%还有很大的上升空间。白羽肉鸡是快大型商品化选育的鸡种，具有生长快，产肉多的特点，但肉质较差。 地方优质鸡品种肉质鲜嫩，风味佳，但是生长缓慢，产肉较少。二战以后，快大型白羽肉鸡的 育种进展很快，与1957年相比，快大肉鸡达到上市体重的时间缩短了 69天，目前只需32天 即可上市。优质鸡在我国有丰富的种质资源，粗略统计约有100多个地方鸡种，如三黄鸡， 麻鸡，狼山鸡，油鸡等。这些鸡肉质鲜嫩，色香味美，其中乌鸡还具有很高的药用价值。优质 鸡种长期作为我国肉鸡生产的特色产业，具有广阔的市场空间，深受消费者欢迎。虽然价格 相较于快大型白羽肉鸡要贵一倍甚至更多，但是其需求量仍在不断增长。国外知名的肉鸡 育种公司也一直在觊觎这个庞大市场。但是优质鸡的育种进展缓慢，达到1.5Kg时日龄不 少于50天。目前优质鸡育种工作遵循世代传递清晰的传统育种方法，父系、母系均采用一 年一个世代的育种方案，凭经验选取质量性状，建立育种群进行世代杂交来选育。这样不仅 世代间隔长，选择强度低，并且产肉量和肉质性状与其它质量性状杂交乱配，导致育种效率 低下，遗传进展缓慢。因此目前亟需加快我国优质鸡育种技术体系创新。国家对此也相当 重视，自从1980年国家科委设立优质黄羽肉鸡选育计划以来，其后每个五年计划都有涉及 优质鸡育种攻关计划，以期提高优质肉鸡的产肉量和肉品质。1998年Fire等将双链RNA(dsRNA)注入线虫体内，相关基因的表达被特异性的 抑制，产生了与基因敲除一样的缺陷型。他们把这种基因转录后却被抑制表达的现象叫 做 RNAi (RNA interference)。其机制是生物细胞内的长双链 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)被Dicer酶结合并切成长度为21_23bp的小干扰RNA分子(small interfering RNA, siRNA)。siRNA识别并结合靶基因转录后的mRNA上的同源序列，引导RNA诱导沉默 复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)将mRNA降解，导致转录后的基因沉默 (posttranscriptional gene silencing, PTGS)。近年来的研究发现，RNAi 现象广泛存在 于动植物体内。除了 siRNA以外，具有茎环结构的短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA) 在细胞内经过加工后也可以变成siRNA，并诱导RNA干扰，而且作用时间更为持久。这样使 得针对一些具有潜在利用价值的基因构建shRNA表达载体，并导入生物体内，特异性的对 靶基因表达进行干扰，从而使动植物相关基因的表达被长期沉默成为可能。也预示着动植 物在医学医药，生物科技和畜牧业生产中潜在的巨大实用价值。肌肉生成抑制素基因(Myostatin，MSTN)是1997年McPherron等从小鼠骨骼肌cDNA文库中筛选出的一种负性调控骨骼肌生长的基因。
发明内容
本发明的目的是提供一 种抑制鸡肌肉生成抑制素基因表达的SiRNA及其应用。本发明提供的作用于肌肉生成抑制素基因的小干扰RNA，为如下a)或b)或c)a)由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列组成的双链RNA ；b)由序列表的序列3和序列表的序列4所示核苷酸序列组成的双链RNA ；c)由序列表的序列5和序列表的序列6所示核苷酸序列组成的双链RNA。本发明还保护以上任一所述小干扰RNA在抑制细胞的肌肉生成抑制素基因表达 中的应用。所述肌肉生成抑制素基因可为GenBank Accession Number :ΝΜ_001001461 自 5， 末端第1至1128位核苷酸。所述细胞具体可为鸡胚成肌细胞。本发明还保护以上任一所述小干扰RNA在抑制鸡的肌肉生成抑制素基因表达中 的应用。所述肌肉生成抑制素基因可为GenBank Accession Number :ΝΜ_001001461 自 5， 末端第1至1128位核苷酸。以上任一所述方法均可应用于鸡的育种。本发明获得了有效抑制鸡MSTN基因表达的小干扰RNA，在分子生物学上通过实时 荧光定量PCR证明它有效的降低了 MSTN的表达；在胚胎学上通过显微注射试验成功获得了 骨骼肌明显增大的雏鸡。以上结果说明，本发明的小干扰RNA可用于鸡的育种，从而提高肉 鸡尤其是优质鸡的产肉量。
图1为实施例2中SiRNA转染鸡胚成肌细胞(CEM)后MSTN基因荧光定量实验结^ ο图2为实施例3中注射siRNA-9的实验组雏鸡(a)与对照组雏鸡(b)及相应的解 剖照。图3为实施例3中实时荧光定量PCR检测鸡胚胎期肌肉MSTN基因的表达量的结^ ο
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的“ ％ ”，如无特殊说明，均为质量百分含量。实施例1、siRNA的设计和合成根据NCBI公布的肌肉生成抑制素基因(MSTN)设计三对siRNA如下第一对(siRNA-9):5，-GCUAGCAGUCUAUGUUUAUTT-3，(序列 1)；3，-TTCGAUC⑶CAGAUACAAAUA-5，(序列 2)；
第二对(siRNA-338):5，-CCACAACCGAGACGAUUAUTT-3，(序列 3)；3，-TTGGUGUUGGCUCUGCUAAUA-5，(序列 4)；第三对(siRNA-926):5，-GCUCCGGAGAAU⑶GAAUUTT-3，(序列 5)；3，-TTCGAGGCCUCUUACACUUAA-5，(序列 6)；对照siRNA(siRNA-NC) 5，-UUCUCCGAAC⑶⑶CACGUTT-3，；
3 ’ -TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5 ’。化学合成以上4对SiRNA，化学合成的siRNA为减压离心干燥品，制品干燥于管底， 成干粉状。分别将3对siRNA进行实施例2和实施例3的实验。实验前，分别将siRNA离心 后加入适量DEPC水震荡器混勻制成浓度为20 μ M溶液。实施例2、siRNA转染后鸡胚成肌细胞中MSTN基因的表达量分别用实施例1制备的三对siRNA对鸡胚成肌细胞进行转染实验，具体步骤如 下1、取发育到9天的白来航种蛋(购自中国农业大学动物科技学院试验鸡场)用灭 菌弯头镊撕破鸡蛋内壳膜、尿囊膜和羊膜，夹出鸡胚，放于已加入DPBS的无菌培养皿中漂 洗去血污、杂质。2、将胚胎移至解剖镜下，用眼科镊去除鸡胚胸部皮肤，露出胸肌，从胸腔肋骨处剪 取肌肉。放进装有DPBS溶液的培养皿中。以同样方式分离另一半胸肌肉组织。3、用眼科剪将肌肉组织剪碎成1立方毫米的肉块，加入适量DPBS，用去尖头的移 液器吹打几次，静置后去上清。4、向肌肉糜中加入含15% FBS的DMEM培养基，漩涡振荡器上振荡30s，静置后吸 取上清细胞悬液，重复该步骤3-5次。5、将收集到的细胞悬液吹打数次，使细胞分散均勻，经四层纱布过滤后收集细胞 滤液。6、将细胞滤液接种于大的细胞培养瓶中，37°C CO2培养箱中培养半小时。使其中 混杂的成纤维细胞贴壁。7、轻轻拿出细胞培养瓶，吸出上层细胞培养液，适度稀释后，经台盼蓝染色，计数 其中的活细胞数(鸡胚成肌细胞)。按照3X105细胞/mL的浓度接种到已经0.01%多聚 赖氨酸包被的细胞培养板中。8、六孔板中原代培养鸡胚成肌细胞，当细胞融合度达到50%时，进行转染。9、转染前用DPBS洗去原培养基，换为OPTI-MEM培养基(无血清)；转染液(A液 siRNA 100pmol+250 μ L OPTI-MEM 培养基，室温 5 分钟；B 液脂质体 2000 3 μ L+250 μ L OPTI-MEM培养基，室温放置5分钟；将A、B液混合，室温放置20分钟)逐滴加入每个培养 孔中；同时设对照孔(NC)，用等体积的无菌水代替siRNA;继续培养，6小时后换正常完全培 养基。10,36小时后收集细胞，提取RNA，实时荧光定量进行MSTN基因表达干扰效果检 测。结果见图1(反应设 立β-actin为内对照基因，目的基因与β-actin基因的起始 拷贝数之比，作为该基因的相对表达量)。结果显示转染了 3对siRNA的成肌细胞的MSTN基因表达量显著低于对照组；siRNA-9，siRNA-338的抑制效果达到了 70%。在分子水平上 证明了本发明的siRNA干扰序列可以有效抑制MSTN基因的表达，间接证明了其促进肌肉的 生长的作用，具有活体应 用价值。实施例3、siRN A转染后活体鸡胚中MSTN基因的表达量分别用实施例1制备的三对siRNA和对照siRNA (siRNA-NC)对活体鸡胚进行转染 实验，实验情况见表1。表1活体鸡胚转染实验情况
权利要求
1.作用于肌肉生成抑制素基因的小干扰RNA，为如下a)或b)或c)a)由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列组成的双链RNA；b)由序列表的序列3和序列表的序列4所示核苷酸序列组成的双链RNA；c)由序列表的序列5和序列表的序列6所示核苷酸序列组成的双链RNA。
2.权利要求1所述小干扰RNA在抑制细胞的肌肉生成抑制素基因表达中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述肌肉生成抑制素基因为 GenBankAccession Number :ΝΜ_001001461 自 5，末端第 1 至 1128 位核苷酸。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述细胞为鸡胚成肌细胞。
5.权利要求1所述小干扰RNA在抑制鸡的肌肉生成抑制素基因表达中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述肌肉生成抑制素基因为 GenBankAccession Number :NM_001001461 自 5，末端第 1 至 1128 位核苷酸。
7.权利要求2至6中任一所述应用在鸡的育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抑制鸡肌肉生成抑制素基因表达的siRNA及其应用。本发明提供了作用于肌肉生成抑制素基因的小干扰RNA，为如下a)或b)或c)a)由序列表的序列1和序列表的序列2组成的双链RNA；b)由序列表的序列3和序列表的序列4组成的双链RNA；c)由序列表的序列5和序列表的序列6组成的双链RNA。本发明获得了有效抑制鸡MSTN基因表达的小干扰RNA，在分子生物学上通过实时荧光定量PCR证明它有效的降低了MSTN的表达；在胚胎学上通过显微注射试验成功获得了骨骼肌明显增大的雏鸡。以上结果说明，本发明的小干扰RNA可用于鸡的育种，从而提高肉鸡尤其是优质鸡的产肉量。
文档编号C12N15/11GK102041257SQ20091023540
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月13日 优先权日2009年10月13日
发明者孙研研, 杨宁, 蒋斌, 郑江霞, 陈思睿 申请人:中国农业大学