专利名称：一种促进外源蛋白在植物中表达的方法
技术领域：
本发明涉及一种促进外源蛋白在植物中表达的方法。
背景技术：
水稻矮缩病毒(rice dwarf virus, RDV)是水稻普通矮缩病的病原，1883年首次 在日本被发现，广泛分布于中国、日本、朝鲜、菲律宾、尼泊尔等东南亚水稻产区。此病在水 稻秧田和本田期均能发生，为系统性侵染病害。植株感病后，所有分蘖均能发病。症状为植 株显著矮缩，分蘖增多，叶色浓绿，叶片粗而僵直，沿叶脉出现白色小斑点，形成断续的点线 状(老叶不出现斑点)；如在孕穗后期发病，只在剑叶及其叶鞘上表现清晰的条点病斑；若 在抽穗后发病，仅在剑叶叶鞘上表现病斑。病株根系发育不良，多老朽根，早期发病(苗期 到分蘖期)一般不能抽穗，后期发病呈包茎穗或半包穗，穗小秕谷多。因此，水稻感染该病 后能够造成大面积减产，严重威胁水稻的生产。RDV是呼肠孤病毒科(Reoviridae)植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)的成员 (Boccardo G，1984)。呼肠孤病毒科病毒有一些共同特点，例如病毒粒子呈球状，有双层衣 壳，每个衣壳均呈现20面体对称，直径为60-80nm，没有脂蛋白外膜，外壳由3种蛋白质组 成，核心有4-6种蛋白，核心内含有线状dsRNA，有10-12个基因组分。RDV病毒粒子为无 刺突、无脂蛋白外膜的二十面体，病毒粒子直径为69. 3nm，具有双层外壳蛋白，内壳直径为 53nm。RDV病毒粒子内有单拷贝基因组12条双链RNA，RNA基因组分以超卷曲形式包装在 病毒粒子内，与蛋白质组成复合体。依照dsRNA在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率，由慢到 快，依次命名为Sl到S12。RDV基因组编码6-7种结构蛋白(包括Pl，P2，P3，P5，P7，P8和 P9)，和至少五种非结构蛋白(包括Pns4, Pns6, PnslO, Pnsl 1，Pnsl2)。Pnsll的编码序列有两个0RF，这两个ORF的读码框相同，但第二个ORF的AUG密 码子满足Kozak保守转录的要求，在感病的植株和昆虫体内表达量较高。其编码一个181 个氨基酸组成的20KD蛋白。Sll的3，非编码区很长，占整个片段的46.4%，远远高于RDV 其他片段3'非编码区的相对长度(约占3.1%-17.7%)。基因沉默(gene silencing，或称为RNA沉默，RNA silencing)是指在基因组中虽 然基因以完整的形式存在，但其表达却受到抑制的现象。RNA沉默广泛存在于从真菌到高等 植物、从无脊椎动物到哺乳动物各种生物中。在高等植物中，基因沉默现象被认为是植物抵抗病毒入侵的一个普遍的防御机 制。目前现在至少有三类证据直接证明RNA沉默在抗病毒过程中起着重要的作用首先，在 病毒侵染植物时，会诱发RNA沉默系统剪切病毒基因组生成siRNA ；第二，许多植物病毒和 部分动物病毒都编码有RNA沉默抑制因子来用以对抗宿主的RNA沉默系统；第三方面的证 据来自于一些RNA沉默相关基因突变体对病毒感染的敏感性。 植物通过VIGS (virus induced gene silencing)产生的系统RNA沉默信号的传 播而获得整体植株的抗病毒效果。同时病毒为了能够成功侵染植物也一套反防御机制，他 们编码的RNA沉默抑制因子(RNA silencing suppressor, RSS)能够通过不同的机制来抑制宿主中的RNA沉默现象，帮助病毒在宿主细胞中复制，增殖和传播，从而成功完成侵染过 程。到目前为止，从植物病毒内发现的RNA沉默抑制因子已经有近四十种，而编码这些沉默 因子的病毒几乎涵盖了所有类型，即无论单链RNA(正义和负链)病毒、DNA病毒还是双链 RNA病毒都编码RNA沉默抑制因子。转基因也是对机体的外源基因入侵，RNA沉默对之也有抵抗作用。1990年，Napoli 等首先在转基因矮牵牛中发现了这类现象，但到目前为止这种现象发生的机制仍不清楚。 一种可能是转 入外源基因在插入基因组过程中会被机体某种机制标示，在基因转录过程中 被RdRP识别，转录形成dsRNA;另外植物体内某一个基因非正常过量转录时，可能会有一部 分mRNA出现非特异修饰(例如没有进行5’加帽、3’polyA加尾等)，同样会被RdRP识别生 成dsRNA;当然，如果转基因过程中插入的是多个拷贝且插入位点相近时，转基因本身在转 录过程中也可能形成反向重复，导致转录时形成dsRNA。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进外源蛋白在植物中表达的方法。本发明保护水稻矮缩病毒的Pnsll基因的一种新用途，即水稻矮缩病毒的Pnsll 基因或其DNA片段在抑制RNA沉默中的应用。所述Pnsll 基因可为 GENBANK ACCESSION NUMBER :NC_003767 所示的 DNA。所述Pnsll 基因的 DNA 片段的序列可如 GENBANK ACCESSION NUMBER :NC_003767 自5’端第30位至572位核苷酸序列所示。本发明还保护一种促进外源蛋白在植物中表达的方法，为如下(a)或(b)(a)将水稻矮缩病毒的Pnsll基因和外源蛋白的编码基因均导入目的植物中，从 而促进外源蛋白在目的植物中的表达；(b)将水稻矮缩病毒的Pnsll基因的DNA片段和外源蛋白的编码基因均导入目的 植物中，从而促进外源蛋白在目的植物中的表达。所述Pnsll 基因可为 GENBANK ACCESSION NUMBER :NC_003767 所示的 DNA。所述Pnsll 基因的 DNA 片段的序列可如 GENBANK ACCESSION NUMBER :NC_003767 自5’端第30位至572位核苷酸序列所示。所述水稻矮缩病毒的Pnsll基因(或其DNA片段)和外源蛋白的编码基因可通 过同一个重组表达载体导入目的植物中，也可分别通过各自的重组表达载体导入目的植物 中。所述Pnsll基因(或其DNA片段)具体可通过含有所述Pnsll基因(或其DNA片 段)的重组表达载体导入目的植物中。所述重组表达载体具体可为将PE3质粒的ClaI和 KpnI位点间插入Sll基因(或其DNA片段)得到的pE3_Sll质粒。所述目的植物可为烟草，如本氏烟草(Nicotiana benthamiana)或转入GPF基因 的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)(如 Nicotiana benthamiana line 16c)。所述外源基因可为GFP基因。所述GFP基因具体可为GENBANK ACCESS 10NNUMBER U55761中自5，末端第97至816位核苷酸序列所示的DNA。本发明通过实验证明水稻矮缩病毒非结构蛋白Pnsll，作为水稻矮缩病毒的第二 个基因沉默抑制因子，能够显著提高GFP基因在本氏烟草中的的表达量和表达持续时间，与已鉴定的基因沉默抑制因子Tav2b具有类似的提高基因瞬时、稳定表达量的功能，是一 种新的基因沉默抑制因子，从而为利用植物材料快速、大量表达异源蛋白提供了有效的技 术路线。本发明具有较高的实际应用价值。
图1为实施例2中，注射5天后，Pnsll对外源蛋白表达的促进作用；A 紫外照射 下的照片；B =Northern blot检测结果，以28S rRNA作为mRNA的标示。图2为实施例3中，注射5天后，Pnsll对外源蛋白表达的促进作用；A 紫外照射 下的照片；B =Northern blot检测结果，以28S rRNA作为mRNA的标示。图3为实施例4中，注射5天后，Pnsll对外源蛋白表达的促进作用；A 紫外照射 下的照片；B =Northern blot检测结果，以28S rRNA作为mRNA的标示。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。GFP 的转基因烟草 Nicotiana benthamiana line 16c 为组成型表达 GFP 的转基因本氏烟草。本氏烟草(Nicotiana benthamiana)和GFP的转基因烟草 Nicotianabenthamiana line 16c (简称16c烟草)均种植于蛭石与营养土 1 1混和的 土中，放于人工气候室内培养，光照条件为16小时光照，8小时黑暗。培养温度光照条件下 25°C，黑暗条件下20°C。烟草萌发3-4周，两片真叶期将小苗移至大花盆中继续培养，根据 烟草状态保湿培养两周到4-6叶期后，去除保湿炼苗3天备用。本氏烟草(Nicotianabenthamiana)、GFP 的转基因烟草 Nicotiana benthamianaline 16c (简称 16c 烟草)、pE3、pGR107、pWMlOl、大肠杆菌 DH5 α 和 ΕΗΑ105 北京大学；参见文献:Cao, X. S.，Zhou, P.，Zhang, Χ. Μ.，Zhu, S. F.，Zhong, X. H.，Xiao, Q.， Ding, B.，and Li, Y. (2005). Identification of an RNA silencingsuppressor from a plant double-stranded RNA virus. J Virol 79,13018-13027。实施例1、植物表达载体的构建一、pE3_Sll制备含有Sll 基因(GENBANK ACCESSION NUMBER :NC_003767 自 5'末端第 30 至 572位核苷酸)和两端分别带有ClaI和KpnI酶切位点的DNA片段(序列1所示DNA) ；DNA 片段使用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后使用ClaI和KpnI双酶切，与使用同样酶切过的载体 PE3连接；连接产物转化大肠杆菌DH5 α，提取阳性质粒进行酶切和测序鉴定。结果表明，得 到了植物表达载体PE3-S11 (骨架质粒为ρΕ3，在35S启动子下游，ClaI和KpnI位点间插入 了 Sll基因；即在ρΕ3的ClaI和KpnI酶切位点间插入序列1所示DNA)。二、pWMlOI-GFP制备上下游带有HindIII酶切位点的GFP基因(序列2所示DNA)。HindIII酶 切GFP基因，与使用同样酶切过的载体ρ丽101连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，提取 阳性质粒进行酶切和测序鉴定。结果表明，得到了植物表达载体PWM101-GFP(骨架质粒为ρ丽101，在HindIII位点插入了 GFP ；即在pWMlOl的HindIII位点插入序列2所示DNA)。实施例2、本氏 烟草中Sll (Pnsll)基因对外源蛋白表达的促进作用一、农杆菌的电击转化分别制备含有pE3-Sll、pE3和pWM101_GFP的重组农杆菌，方法如下(1)农杆菌的电击转化感受态的制备农杆菌EHA105 (OD600 = 1. 5 -2)，在2200g的相对离心力下，离心5分钟。去上清， 用灭菌的去离子水洗至少六遍。最后用10%甘油重悬菌液至浓度约为4-6X IollceIlsAil, 分装后保存在-70°C。(2)农杆菌的转化60 μ 1农杆菌菌液加小于5 μ 1的质粒(pE3_Sll、pE3或pWM101-GFP)，混勻后加 入电击杯中，冰上放置5分钟，擦干电击杯外部的水分，放入电击转化仪中(BTX，Model ECM 630)。电击转化条件为模式2·5kV/RES I STANCE High Voltage (HV)电击杯类型BTX Disposable Cuvette P/N 610 (lmm gap)电容50 μ F电阻125 Ω电压1.4kV额定场强14·4kV/cm额定脉冲长度5· Omsec转化后的菌液28°C静置1小时以上。2200g离心5分钟，混勻后涂在含有50mg/L 利福平和50mg/L卡纳霉素的培养基上，置于28°C培养48h。二、农杆菌的渗透注射1、农杆菌的培养挑取步骤一的单菌落，在含有50mg/L利福平和50mg/L卡纳霉素的3-5ml LB培养 基中接种，28°C摇床200rpm振荡过夜培养至菌浓度OD6tltl = 1-2。按1 1000扩大培养至 菌浓度 OD6tltl = 1-2。2、渗透注射农杆菌悬液的制备将扩大培养的菌液经过2000g离心5分钟收集，去除上清。使用渗透注射缓冲液 重悬菌体至浓度为0D_ = 1。渗透注射缓冲液的组成为
水(高压灭菌)
MESIOraM
AS150 μ M
MgCl2IOmM室温下放置3小时以上。分别得到三种渗透注射农杆菌悬液含有重组农杆菌甲(携带pE3-Sll的 ΕΗΑ105)的渗透注射农杆菌悬液PE3-S11、含有重组农杆菌乙(携带ρΕ3的ΕΗΑ105)的渗透注射农杆菌悬液PE3、含有重组农杆菌丙(携带pWMlOI-GFP的EHA105)的渗透注射农杆菌悬液 pWMlOI-GFP。3、农杆菌的渗透注射渗透注射液A:将渗透注射农杆菌悬液pE3-Sll和渗透注射农杆菌悬液 PWM101-GFP混合；重组农杆菌甲和重组农杆菌丙的浓度比为0. 7 0.3。渗透注射液B 将渗透注射农杆菌悬液pE3和渗透注射农杆菌悬液pWMlOI-GFP混 合；重组农杆菌乙和重组农杆菌丙的浓度比为0.7 0.3。选取健壮4-6叶期本氏烟草，叶子直径应该在2-4厘米左右，在叶片上用一次性注 射器针头打小孔。用Iml注射器吸取渗透注射液A (或渗透注射液B)，除去针头，左手食指 前端平顶叶片针孔处，把握力度稍微用力。右手轻推注射器使液体缓慢注射入叶片内，液体 开始进入叶片后即减轻力度，让液体慢慢渗透进入叶片。为了尽可能的保证实验的严格性， 使得对照组和实验组的表达环境一致，在同一个叶片的主叶脉的两边分别注射渗透注射液 A (实验组)和渗透注射液B (对照组)。三、Sll基因对外源蛋白表达的促进作用1、紫外检测GFP在长波长紫外灯(Black Ray model B 100A，UV products)照射下呈绿色，而 野生型烟草叶片呈红色(叶绿素在紫外光激发下的自发红色荧光)。注射后的2-7天观察。 所用照相为尼康数码相机(Nikon digital camera D70)，镜头为微聚镜头加装黄色滤光片 Y48。手动模式参数光圈1/8 ；速度10-20秒；白平衡荧光。在注射超过48小时以后，实验组和对照组的注射区域都能看到很强的外源表达 的GFP绿色荧光，没有明显强度的差异。从第3天开始，对照组的叶片区域的绿色荧光蛋白 逐渐减弱，至第5-7天则完全没有GFP荧光而呈现红色。在注射5天后，实验组的叶片区域 仍然有一定量的GFP绿色荧光表达。注射5天后，叶片的紫外照射下的照片见图1A。2、Northern blot注射后第5天，采用Trizol —步法从叶片注射区域提取总RNA，并用地高辛标记的 GFP探针进行mRNA的Northern杂交验证。Northern杂交方法参照Roche公司的‘TheDIG system user' s guide for filter hybri dization'操作手册进行。探针标记用PCR方法，选用Roche公司试剂盒，反应体系为
模板(pWMlOl —GFP)1μ 1
dNTP (其中含地高辛标记dUTP)1 μ 1
IOXPCR缓冲液2 μ 1
引物(10μΜ)2Χ μ 1
Tag DNA聚合酶1 μ 1
无菌水13 μ 1反应体系中的引物pGFPEcoRIF5，-TATGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3，；pGFPBamHIR 5’ -GCTGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCC-3’。Northern blot检测结果如图IB所示。实验组的叶片区域在第5天仍有GFP mRNA的积累。对照组的叶片区域在第5天不能检测到GFP mRNA的积累量。紫外 检测和Northern blot中，均可检测到实验组和对照组的差异。实验组和对 照组出现差异的原因在于外源GFP基因转入后，在前3天大量表达；随着时间的延续，夕卜 源GFP基因的转录诱发本氏烟草出现基因沉默现象，外源转录的GFP mRNA被逐步剪切掉， 不能合成新的GFP蛋白，前3天大量转录产生的GFP蛋白也逐步降解，从而GFP蛋白的表达 量大大降低。结果表明，Sll基因在瞬时表达系统中能够抑制由外源单链RNA诱发的RNA沉 默现象，从而促进外源蛋白的表达。实施例3、16c烟草中Sll (Pnsll)基因对外源蛋白表达的促进作用一、农杆菌的电击转化同实施例2的步骤一。二、农杆菌的渗透注射用16c烟草代替本氏烟草，其它同实施例2的步骤二。三、Sll基因对外源蛋白表达的促进作用1、紫外检测16c烟草叶片在紫外光下呈现的是GFP的绿色，如果在叶片局部通过渗透注射的 方法再次表达外源的GFP时，就会诱发内源的GFP发生基因沉默现象，发生了基因沉默的区 域呈现红色。方法同实施例2的步骤三的1。从第3天开始，对照组的叶片区域绿色荧光蛋白逐渐减弱，至第6-7天则完全变 红。在注射5天后，实验组的叶片区域仍然有一定量的GFP绿色荧光表达。注射5天后，叶 片的紫外照射下的照片见图2A。2、Northern blot方法同实施例2的步骤三的2。Northern blot检测结果如图2B所示。实验组的叶片在第5天仍有GFP mRNA的 积累。对照组的叶片区域中GFP的mRNA的积累量不能被检测的到。紫外检测和Northern blot的结果均可表明，Sll基因在瞬时表达系统中能够抑 制由外源单链RNA诱发的RNA沉默现象，从而促进外源蛋白的表达。实施例4、16c烟草中Sll(Pnsll)基因对外源蛋白表达的促进作用一、重组表达载体的制备马铃薯X病毒(potato virus X，PVX)是单链正义的RNA病毒，其编码的p25蛋白 是一个RNA沉默抑制因子。而且由于宿主内RNA沉默机制的限制，p25突变的PVX虽然可 以在烟草中复制，但是其转录水平却很低。这样，PVX就提供了一个研究RNA沉默抑制因子 在病毒诱导RNA沉默体系内作用的很好的平台。1、PVXA25KPVX病毒侵染性克隆载体PGR107经Bsu36I酶切(切去了 p25K蛋白的第29到第 74位的氨基酸)，之后用Τ4 DNA聚合酶补平连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，提取阳性 质粒进行酶切和测序鉴定。结果表明，得到了 PVX Δ 25Κ (ρ25Κ蛋白的第74位后氨基酸移码 突变，这样Ρ25Κ蛋白只有29个氨基酸表达)。2、PVXA25k_Sll
制备含有Sll 基因(GENBANK ACCESSION NUMBER :NC_003767 自 5'末端第 30 至 572位核苷酸)和两端分别带有ClaI和SalI酶切位点的DNA片段(序列3所示DNA)； DNA片段使用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后使用ClaI和SaLI双酶切，与使用同样酶切过的 PVXA25K连接；连接产物转化大肠杆菌DH5 α，提取阳性质粒进行酶切和测序鉴定。结果表 明，得到了 P VXA25k-Sll (骨架质粒为PVX Δ 25K，在ClaI和SaLI位点间插入了 Sll基因； 即在PVX Δ 25Κ的ClaI和SaLI酶切位点间插入序列3所示DNA)。3、pWM101_GFP采用实施例1中制备的pWMlOI-GFP。二、农杆菌的电击转化分别制备含有PVX Δ 25k_Sll、PVX Δ 25k和pWM101_GFP的重组农杆菌，方法同实施
例2的步骤一。三、农杆菌的渗透注射1、农杆菌的培养同实施例2的步骤二的1。2、渗透注射农杆菌悬液的制备方法同实施例2的步骤二的2。分别得到三种渗透注射农杆菌悬液含有重组农杆菌1(携带PVXA25k_Sll 的EHA105)的渗透注射农杆菌悬液PVX Δ 25k-Sll、含有重组农杆菌II (携带PVX Δ 25k 的EHA105)的渗透注射农杆菌悬液PVX Δ 25k、含有重组农杆菌丙(携带ρ丽101-GFP的 ΕΗΑ105)的渗透注射农杆菌悬液pWMlOl-GFP。3、农杆菌的渗透注射渗透注射液A 将PVXA 25k_Sll和渗透注射农杆菌悬液pWM101_GFP混合。重组 农杆菌I和重组农杆菌丙的浓度比为0.7 0.3渗透注射液B 将PVX Δ 25k和渗透注射农杆菌悬液pWM101_GFP混合。重组农杆 菌II和重组农杆菌丙的浓度比为0.7 0.3选取健壮4-6叶期16c烟草，叶子直径应该在2-4厘米左右，在叶片上用一次性注 射器针头打小孔。用Iml注射器吸取渗透注射液A (或渗透注射液B)，除去针头，左手食指 前端平顶叶片针孔处，把握力度稍微用力。右手轻推注射器使液体缓慢注射入叶片内，液体 开始进入叶片后即减轻力度，让液体慢慢渗透进入叶片。为了尽可能的保证实验的严格性， 使得对照组和实验组的表达环境一致，在同一个叶片的主叶脉的两边分别注射渗透注射液 A (实验组)和渗透注射液B (对照组)。四、Sll基因对外源蛋白表达的促进作用1、紫外检测16c烟草叶片在紫外光下呈现的是GFP的绿色，如果在叶片局部通过渗透注射的 方法再次表达外源的GFP时，就会诱发内源的GFP发生基因沉默现象，发生了基因沉默的区 域就呈现红色。方法同实施例2的步骤三的1。注射48小时后所有注射区域都有明显可见的GFP荧光出现。注射5天后，对照组 的叶片区域的GFP荧光消失，注射区域呈现红色荧光。注射5天后，实验组的叶片区域仍然可见GFP绿色荧光。注射5天后，叶片的紫外照射下的照片见图3A。2、Northern blot 方法同实施例2的步骤三的2。Northern blot检测结果如图3B所示。实验组的叶片在第5天仍有GFP mRNA的 积累。对照组的叶片区域中GFP的mRNA的积累量不能被检测的到。紫外检测和Northern blot的结果均可表明，Sll基因在病毒载体系统中能够抑 制由外源单链RNA诱发的RNA沉默现象，从而促进外源蛋白的表达。序列表<110>北京大学<120> 一种促进外源蛋白在植物中表达的方法<130>CGGNARY92584<160>3<210>1<211>560<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1gtatcgatga cggcgagtga atcattcgtt ggcatgcaag ttttggctca agacaaagaa 60gtcaaagcga cctttattgc tctcgacagg aaattacctg ccaatctgaa agtaccatac 120atgaaaaatg ctaaatatag aacttgtatt tgtccaagtt caaaccattt ggtagatgac 180tgtgtatgcg aagatgtgat tattgcgtat actgcacaca gaaataatgc ggtagctgcc 240cttttgtata gtgacggaaa cgtcatacac aagagcggta ctttgaaacc taaatcccaa 300aatcggtttg atttacgtgg ttttttaacc agtgctaacc caggggaaag ctcaaaagct 360gaagccggca cctcgaaatc cacgcaaaag gcgtacgaca ggaaggataa gtccccttct 420aaaggcaaaa attcaaagaa aggtggtaaa aaatcttcat ccgcaagaaa gaggaaagaa 480tattcttcaa attctgaaac ggatttgagt tctgacagtg atgccaatac tcgcaaatca 540aagcgtaagt aaggtaccag560<210>2<211>734<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>2tgaagcttat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg60agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg 120ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct 180
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权利要求
1.水稻矮缩病毒的Pnsll基因或其DNA片段在抑制RNA沉默中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述Pnsll基因为GENBANK ACCESS IONNUMBER :NC_003767所示的DNA ；所述Pnsll基因的DNA片段的序列如 GENBANKACCESSION NUMBER :NC_003767 自 5，端第 30 至 572 位核苷酸所示。
3.一种促进外源蛋白在植物中表达的方法，为如下(a)或(b)(a)将水稻矮缩病毒的Pnsll基因和外源蛋白的编码基因均导入目的植物中，从而促 进外源蛋白在目的植物中的表达；(b)将水稻矮缩病毒的Pnsll基因的DNA片段和外源蛋白的编码基因均导入目的植物 中，从而促进外源蛋白在目的植物中的表达。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述Pnsll基因为GENBANK ACCESS I ONNUMBER :NC_003767所示的DNA ；所述Pnsll基因的DNA片段的序列如 GENBANKACCESSION NUMBER :NC_003767 自 5，端第 30 至 572 位核苷酸所示。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述Pnsll基因通过含有所述Pnsll基 因的重组表达载体导入目的植物中；所述Pnsll基因的DNA片段通过含有所述Pnsll基因 的DNA片段的重组表达载体导入目的植物中。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述重组表达载体为如下(c)或(d)(c)将pE3质粒的ClaI和KpnI位点间插入Pnsll基因得到的重组质粒；(d)将pE3质粒的ClaI和KpnI位点间插入Pnsll基因的DNA片段得到的重组质粒。
7.如权利要求3至7中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为烟草。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在所述烟草为本氏烟草 (Nicotianabenthamiana)或转入 GPF 基因的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)。
9.如权利要求3至8中任一所述的方法，其特征在于所述外源基因为GFP基因。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述外源基因为GENBANK ACCESS I ONNUMBER :U55761中自5，末端第97至816位核苷酸序列所示的GFP基因。
全文摘要
本发明公开了一种促进外源蛋白在植物中表达的方法。本发明提供了水稻矮缩病毒的Pns11基因的一种新用途，即水稻矮缩病毒的Pns11基因或其DNA片段在抑制RNA沉默中的应用。基于该新用途，本发明提供了一种促进外源蛋白在植物中表达的方法，是将水稻矮缩病毒的Pns11基因或其DNA片段和外源蛋白的编码基因均导入目的植物中，从而促进外源蛋白在目的植物中的表达。本发明为利用植物材料快速、大量表达异源蛋白提供了有效的技术路线。本发明具有较高的实际应用价值。
文档编号C12N15/82GK102041269SQ20091023540
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月13日 优先权日2009年10月13日
发明者李毅, 高锋, 魏春红 申请人:北京大学