甲基?β?环糊精在提高杆状病毒外源蛋白表达量中的应用
【专利摘要】甲基?β?环糊精在提高杆状病毒外源蛋白表达量中的应用，本发明用一定浓度MβCD孵育用于表达外源蛋白的细胞，能显著的提高昆虫杆状病毒感染效率并提高外源蛋白的表达量。本发明可明显改善杆状病毒表达系统的表达效率，同时MβCD本身易溶于水和有机溶剂，已经广泛的应用于药品和食品行业，具有良好安全性，因此应用杆状病毒表达药用蛋白同样可以应用本方法。本发明提供的方法容易理解，操作简单易行，效果明显。
【专利说明】
甲基-e-环糊精在提高杆状病毒外源蛋白表达量中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于病毒学领域W及蛋白质表达系统领域，设及甲基-0-环糊精(Methyl- 0-cyclodextrin，简称她CD，也有表示为MBCD，Me-0CD，MeBCD)提高昆虫杆状病毒入侵效率， 进而提高外源蛋白表达量的具体应用方法。
【背景技术】
[0002] 杆状病毒是一类具有囊膜的双链DNA病毒，自然界中主要感染鱗翅目、膜翅目和双 翅目昆虫。自Smith等人首次利用首猜银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nucleopolyhe化ovi;rus，AcMNPV)作载体成功表达人0-干扰素 W来，至今已用杆状病毒表达 的蛋白有千种（Acharya A,Sriram S&Saehrawat S.Bombyx mori nucleopolyhedrovirus molecular biology and biotechnological applications for large-scale synthesis of recombinant proteins.Curr Sci 2002,83:455-465.)，目前应用的昆虫杆状病毒表达 系统主要有AcMNPV和家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhe化ovi;rus，BmNPV)， 由于杆状病毒具有强大多角体启动子及PIO启动子，表达的外源蛋白具有较好的修饰加工， 具有良好的生物学活性，而且其基因组可W插入较大片段外源DNA等，所W昆虫杆状病毒表 达系统已被公认为是优良的真核表达系统。近年来，利用重组杆状病毒生产的药物及疫苗 已经上市，例如利用杆状病毒表达系统生产的人乳头瘤病毒疫苗(Cervarix?，葛兰素史克） 已经上市，并取得非常好的免疫效果。
[0003] 为了更好的利用杆状病毒表达外源蛋白，国内外许多学者致力于如何提高其表达 量方面的研究:法国学者将病毒中组织蛋白酶基因、几下质酶基因和plO基因破坏W增加表 达量(专利:改进的杆状病毒表达系统，公开号：103748229A);美国科学家通过利用多种信 号肤改变外源蛋白加工与分泌（专利：Method to improve the efficiency of processing and secretion of foreign genes in insect systems. Uni ted States.Patent 5278050)?提高表达量。一系列经过改造的杆状病毒在应用中都需要通过 重组病毒的繁殖、大量扩增环节，才能应用于外源蛋白的表达，在重组病毒制备及扩增过程 中，需要消耗大量的人力财力，如果能在病毒感染的过程中，应用一定手段提高感染效率、 进而提高其表达量，可节省人力物力，降低成本，达到事半功倍的效果。
[0004] MKD，是0-环糊精(e-CD)的烷基化衍生物，白色粉末，无毒、无嗅、微甜，易溶于水 和有机溶剂，在食品及药物中得到了广泛应用。谢伯泰等综述了 M0CD在口服药、鼻腔喷雾 剂、栓剂W及透皮吸收剂方面的应用前景，并且指出M0CD是毒性比较小的药物稳定剂、增溶 剂及吸收促进剂，但要注意她CD使用剂量，W保证其具有较好的安全性(谢伯泰，马晓明，姚 孙贤，谢薇梅.甲基化-e-环糊精的特性及其在药物中的应用.中国新药杂志2009年第18卷 第8期705-709.)。本课题组前期在研究杆状病毒入侵过程时发现M0CD在较高浓度下，可W 抑制BmNPV感染BmN细胞，正是在运用一系列的连续浓度梯度M0CD研究抑制入侵的过程中， 意外的发现当使用低浓度她CD时，非但没有抑制病毒的感染，反而增强病毒的感染性，最终 增加了杆状病毒的对外源蛋白的表达量。利用她CD提高杆状病毒感染率及外源蛋白表达量 方面还没有报道，所w本发明是首次对运种提高杆状病毒表达载体外源蛋白表达量的方法 做具体报道。
【发明内容】
[0005] 解决的技术问题:本发明的目的是提供一种化学药物一一M0CD的新用途，提供应 用一定浓度的甲基-e-环糊精提高杆状病毒外源蛋白表达量的新方法，该方法简便，成本低 廉，易于操作推广。
[0006] 技术方案：甲基-0-环糊精在提高昆虫杆状病毒表达系统外源蛋白表达量中的应 用。
[0007] 所述昆虫杆状病毒为AcMNPV病毒或BmNPV病毒。
[000引所述表达系统为sf21、s巧或BmN细胞。
[0009] 所述表达系统为贴壁培养及悬浮培养的细胞。
[0010] 所述甲基-e-环糊精的工作浓度为0.125-2mM。
[0011] 甲基-0-环糊精在提高昆虫杆状病毒入侵宿主细胞的效率的应用。
[0012] 提高昆虫杆状病毒表达系统外源蛋白表达量的组合物，有效成分包括甲基-0-环 糊精。
[001引1.M0CD(购自Sigma公司）溶液的配制及杆状病毒准备
[0014] 用1 XPBS溶解MPCD，配制浓度为50~lOOmM的储存液备用。
[0015] 将重组杆状病毒感染敏感宿主细胞，感染后60-9化收获出芽病毒(Budded virus， BV)，用终点稀释法测定病毒滴度，4°C避光保存用于后续研究。
[0016] 2.细胞的解育
[0017] 将对数生长期的昆虫细胞接种到培养皿/板中，不同细胞株保持其最适密度，比如 sf 21和sf9保持在约5 X 104个细胞/cm2，BmN细胞约1 X 104个细胞/cm2，贴壁12-2地后，用配 制好的M0CD储存液加入到贴壁昆虫细胞培养液中，使M0CD终浓度分别为0.125~2mM，解育 10-120min，解育细胞溫度为24-29°C，WOmM M0CD(即等体积1 XPBS)解育液作为对照。解育 时间到后，分别去除（或者不去除nxPBS和不同浓度的MKD解育液，用无血清的TC-100培 养基轻轻冲洗细胞2次。
[0018] 3.病毒感染效率分析及外源蛋白表达量分析
[0019] 接着用感染复数(multiplicity of infection,M0I)为0.01~50的杆状病毒感染 相应的宿主细胞，感染60-120min后，除去病毒液，用无血清培养基轻轻洗涂细胞两次(也可 不洗），加入正常的培养基，感染后化利用流式细胞仪分析被感染细胞中巧光表达效率，确 定病毒感染效率。外源蛋白表达量分析则收集感染后24-120h细胞样品，检测细胞中表达的 巧光素酶活性，比较不同处理间巧光素酶相对活性差异。
[0020] 有益效果:本发明首次发现MKD的一种新用途。用一定浓度MKD解育用于表达外 源蛋白的细胞，能显著的提高昆虫杆状病毒感染效率并提高外源蛋白的表达量。当用 0.25mM M0CD解育BmN细胞时，BmNPV病毒感染的细胞数量提高了35%左右，而巧光素酶的活 性比对照提高了 799%，其它浓度的增强效果也达到极显著水平;AcMNPV入侵效率提高了 51%。本发明公开的用途，可明显改善杆状病毒表达系统的表达效率，同时M0CD本身易溶于 水和有机溶剂，已经广泛的应用于药品和食品行业，具有良好安全性，因此应用杆状病毒表 达药用蛋白同样可w应用本方法。本发明提供的方法容易理解，操作简单易行，效果明显。
【附图说明】
[0021] 图1.不同浓度她CD预处理sf 21细胞对AcMNPV病毒感染率分析图。分别用终浓度为 OmM(等体积的 1 X PBS作为对照，CTRL)、0.125mM、0.25mM、0.5mM、ImM、2mM的她CD处理30min 后，再用AcBac-eg巧感染(M0I = 5Hh，去除感染液后正常培养。6h后用流式细胞仪检测细胞 相对感染率，其中CT化感染率设为100 %，其他各处理相对感染率如图所示，*表示与对照相 比较差异显著(P<〇.05)，**表示与对照相比较差异极显著(P<0.01)。
[0022] 图2.不同浓度MKD预处理sf 9细胞对AcMNPV病毒感染率分析图。分别用终浓度为 OmM(等体积的 1 X PBS作为对照，CT化）、0.125mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM、ImM、1.5mM、2mM的M PCD处理sf 9细胞30min后，用AcBac-egf p感染(MOI = 5)化，去除感染液后正常培养，6h后用 流式细胞仪检测细胞感染率。**表示与对照相比较差异极显著(P<〇.01)。
[0023] 图3.不同浓度的M0CD对AcMNPV病毒外源蛋白表达量影响示意图（感染后9化）。分 别用终浓度为OmM(等体积的 1 X PBS作为对照，CTRL)、0.125mM、0.25mM、0.5mM、ImM、2mM CD处理sf 21 30min后，接着用AcBac-Luc (MOI = 5)分别感染不同处理细胞Ih，去除感染液后 正常培养，在感染后96h收集细胞检测巧光素酶活性。**表示与对照相比较差异极显著(P< 0.01)。
[0024] 图4.0.25mM的MPCD处理细胞，AcMNPV表达巧光素酶的时相分析图（MOI = 5)。用 0.25mM MKD解育sf21细胞30min后，用AcBac-Luc分别感染她CD及对照细胞(M0I = 5)，27°C 感染Ih后，移去病毒液，在感染后2地、4她、72h、96h、12化各时间点收集样品，检测分析巧光 素酶相对活性。*表示与对照相比较差异显著(P<〇.05)，**表示与对照相比较差异极显著(P <0.01)。
[0025] 图5.不同浓度她CD处理BmN细胞后对BmNPV感染率分析图。使用MPCD终浓度分别为 0.125mM、0.25mM、0.5mM、lmM、2mM，对照加入相应体积lXPBS，27°C解育30min后去除解育 液，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍后用BmBac-e奸P (M0I = 5) 27 °C感染化，移去病毒液， 清洗两遍，放置于27°C培养箱培养化后，流式细胞仪统计感染细胞数。**表示与对照相比较 差异极显著(P<0.01)。
[0026] 图6 .M0CD(0.25mM)解育细胞时间对BmNPV感染率影响示意图。终浓度为0.25mM CD 27°C分别解育10、30、45、60、90、120min，对照加入相应体积1 X PBS。然后去除解育液，用 无血清的TC-100培养基轻轻冲洗细胞2次，接着用BmBac-eg巧感染细胞(M0I = 5)，27°C感染 化后去掉病毒液，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍，放置于27°C培养箱培养化后，流式细 胞仪统计巧光细胞数量。*表示与对照相比较差异显著(P<〇.05)，**表示与对照相比较差异 极显著(P<0.01)。
[0027] 图7 .不同浓度M0CD对BmNPV病毒（不同感染剂量)表达的巧光素酶活性影响示意 图。使用0.125mM、0.25mM、0.5mM、MKD终浓度27°C解育BmN细胞30min，对照加入相 应体积1 XPBS,后去除解育液冲洗细胞2次，用病毒BmBac-Luc(M0I = 1及MOI = 0.1)感染BmN 细胞，27°C感染化后去除病毒液，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍，放置于27°C培养箱培 养24h后测定细胞中巧光素酶活性。深灰色柱状图为M0I = 1感染剂量，**表示各处理与对照 达到极显著水平(P<0.01);浅灰色为M0I = 0.1感染剂量，T表示处理与对照达到显著水平(P <0.05)，巧表示各处理与对照达到极显著水平(P<0.01)。
【具体实施方式】
[002引 WAcMNPV 为例：
[0029] 用1 X PBS(购自上海生工生物工程股份有限公司）溶解邮CD，配制浓度为50mM的储 存液。
[0030] 为了便于观察及统计本发明所述的提高外源蛋白的表达效率，分别将hsp70操纵 下的报告基因 eg巧和AcMNPV多角体基因启动子控制下的巧光素酶基因转座到AcMNPVBac- t〇-Bac( Invitrogen)的化7转座插入位点，命名AcBac-egfp和AcBac-Luc，提取DNA，转染 sf21，收获出芽病毒粒子(Budded Virus,BV)后，继续用于感染sf21细胞，7化后收获病毒， 终点稀释法测定病毒滴度，4°C避光保存，用于本发明中设及的实例。
[0031] 实施例1:分别用终浓度为0.125mM、0.25mM、0.5mM、的她CD处理后，AcBac- egfp感染率分析(M0I = 5)
[0032] 在24孔细胞培养板中各接种约1 X lO5/孔的sf21细胞，贴壁后，将配制好的MPCD储 存液加入到贴壁细胞sf 21的细胞培养液中，使M0CD终浓度分别为0mM(等体积1 X PBS，图 1CTRL)、0.125mM、0.25mM、0.5mM、lmM、2m]\L27°C解育30min后去除解育液，用无血清TC-100 培养基轻轻冲洗细胞2次(也可不洗），接着用M0I = 5的AcBac-egfp病毒感染不同处理的细 胞，27°C感染化后移去病毒液，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍(也可不洗），添加正常培 养基，放置于27 °C培养箱培养化后，用流式细胞仪统计有巧光表达的细胞数量及总细胞数， 利用excel t测验分析处理与对照组间是否存在显著性差异。实验设=个重复，并重复两 次。图1是M0I = 5AcBac-egfp感染宿主昆虫细胞sf21示例的结果，统计结果显示0.125-2mM 浓度的M0CD处理细胞相对感染率较对照均有显著的增加。
[0033] 实施例2:分别用终浓度为0.125mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM、ImM、1.5mM、2mM 的她 CD 处理sf9后，AcBac-e奸p感染率分析(M0I = 5)
[0034] 在24孔细胞培养板中各接种约IX lO5个/孔的sf9,贴壁后，用配制好的MKD储存 液加入到贴壁细胞S f 9的细胞培养液中，使邮C D终浓度分别为0 m M (等体积1 X P B S，图 1CT化）、0.125mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM、ImM、1.5mM、2mM，27°C解育30min后去除解育液，用 无血清的TC-lOO培养基轻轻冲洗细胞2次，接着用M0I = 5AcBac-egfp分别感染不同浓度地3 CD解育的细胞，27°C感染比后，移去病毒液，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍，添加常规培 养基，放置于27 °C培养箱培养化后，用流式细胞仪统计有巧光表达的细胞数量及总细胞数， 利用excel中t测验分析处理与对照组间是否存在显著性差异。实验设S个重复，并重复两 次。图2是M0I = lAcBac-e奸P感染宿主昆虫细胞sf 9示例的结果，统计结果表明用0.125-2mM 浓度处理细胞后，表达巧光蛋白的细胞数量较对照均有极显著的提高。
[0035] 实施例3:不同浓度的M0CD对AcBac-Luc巧光素酶表达量影响(M0I = 5，感染后96h)
[0036] 在24孔细胞培养板中各接种约IX 105个/孔的sf21，贴壁后，用配制好的她CD储存 液加入到细胞培养液中，使M0CD终浓度分别为0.125mM、0.25mM、0.5mM、等体积的1 XPBS作为对照（即图3CT化），27°C解育30min后去除解育液，用无血清的TC-lOO培养基轻轻 冲洗细胞2次，接着用AcBac-Luc (M0I = 5)分别感染不同处理细胞，27 °C感染比后，移去病毒 液，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍，加入正常培养基，在感染后96h收集细胞检测巧光素 酶活性，各个处理均设=个重复。样品收集时，首先去除培养基，用IXPBS洗两遍，再用50化 L巧光素酶试剂盒(Promega)中裂解液裂解、收集MPCD处理及对照细胞，-80°C保存，直至 120h后收集完所有样品，参照Promega产品指南所述方法用20/20。LuminometeHPromega 公司）检测巧光素酶活性。细胞裂解混合物1200化pm 4°C离屯、5min，取上清进行10倍稀释， 再取化L稀释液与20化底物混合，测定巧光素酶相对活性。图3是AcBac-Luc感染不同浓度药 物处理sf21的结果，统计结果显示在0.25~2mM药物处理的细胞巧光素酶的活性极显著高 于对照。
[0037] 实施例4.终浓度为0.25mM的MKD处理后，AcBac-Luc感染后不同时间点巧光素酶 活性分析(M0I = 5)
[0038] 在24孔细胞培养板中各接种约IX 105个/孔的sf21，贴壁后，用配制好的她CD储存 液加入到细胞培养液中，使她CD终浓度为0.25mM，对照加入相应量的1 XPBS(即图4CTRL)， 27°(：解育3〇111111后去除解育液，用无血清的1'(：-100培养基轻轻冲洗细胞2次，接着用4。8曰(3- Luc分别感染M0CD及对照细胞(M0I = 5)，27°C感染化后，移去病毒液，用无血清的TC-100培 养基轻洗2遍，加入正常培养基，在感染后2地、4她、72h、96h、12化各时间点收集样品，各个 处理均设S个重复。巧光素酶活性的测定见本发明实施例3。图4是Ac丽PV感染sf21示例的 结果，统计结果显示药物处理的细胞巧光素酶的活性显著高于对照(P<〇.05)。
[0039] WBmNPV 为例：
[0040] BmBacJS13是一株与BmNPV具有相同感染特性的Bacmid[Huang JS et al .Construction of the Bac-to-Bac System of Bombyx mori Nucleopolyhe化oviru.Virologica Sinica.2007,22(3) :218-225]。为了便于观察及统计 本发明所述的感染效率，将hsp70操纵下的报告基因 egfp和BmNPV多角体基因启动子操纵下 的巧光素酶基因分别转座到BmBacJS13中化7转座插入位点，命名BmBac-egfp和BmBac-Luc， 提取DNA，转染家蚕细胞，收获BV后，继续用于感染家蚕细胞，7化后收获病毒，终点稀释法测 定病毒滴度，4°C避光保存，用于本发明中W下实例。
[0041 ] 实施例5:不同浓度Mf3CD处理BmN细胞后，表达绿色巧光蛋白细胞感染率比例调查
[0042] 在24孔细胞培养板中各接种约5X104个/孔的BmN细胞，贴壁后，分别取不同量的M PCD储存液加入到细胞培养液中，使M0CD终浓度分别为0.125mM、0.25mM、0.5mM、对 照加入相应体积1 X PBS，27 °C解育30min后去除解育液，用无血清的TC-lOO培养基轻轻冲洗 细胞2次，接着用BmBac-egf P (M0I = 5)分别感染不同处理的细胞，27 °C感染化后，移去病毒 液，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍，添加常规培养基，放置于27 °C培养箱培养化后，流式 细胞仪统计感染细胞数，t测验分析比较不同浓度MKD对病毒感染效率影响。图5是BmBac- egfp感染BmN细胞示例的结果，统计结果显示0.125、0.25、0.5mM M0CD处理组都有显著的增 强效果，感染效率比对照分别提高29%、35%、33%，达到极显著水平(P<0.01)，其它各处理 也有一定增强效果。
[0043] 实施例6:Mf3CD(0.25mM)处理细胞时间与病毒感染率关系
[0044] 在24孔细胞培养板中各接种约5 X 104个/孔的BmN细胞，贴壁后，加入MKD储存液 使终浓度为〇.25mM，对照加入1XPBS，27°C分别解育10、30、45、60、90、120111111。然后去除解 育液，用无血清的TC-100培养基轻轻冲洗细胞2次，接着用BmBac-egfp感染细胞(M0I = 5)， 27°C感染化后去掉病毒液，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍，放置于27°C培养箱培养化 后，流式细胞仪统计巧光细胞数量，t测验分析M0CD解育时间对病毒感染效率的影响。实验 设S个重复。图6是BmBac-egf P感染M0CD解育BmN不同时间示例的结果。统计显示M0CD处理 细胞lOminW上即有较好的增强效果，10-120分钟处理均显著高于对照。
[0045] 实施例7:不同浓度M0CD对不同感染剂量病毒感染细胞中表达的巧光素酶表活性 影响
[0046] 在24孔细胞培养板中各接种约5X104个/孔的BmN细胞，贴壁后，分别取配制好的M PCD储存液加入到细胞培养液中，使M0CD终浓度分别0.125mM、0.25mM、0.5mM、对照 加入相应体积1XPBS，27°C解育30min后去除解育液，用无血清的TC-lOO培养基轻轻冲洗细 胞2次，接着用病毒BmBac-Luc(M0I = 1及M0I = 0.1)感染细胞，27°C感染化后去除病毒液，用 无血清的TC-100培养基轻洗2遍，放置于27 °C培养箱培养2地后测定细胞中巧光素酶活性， 检测方法见本发明实施例3。实验设=个重复。图7是BmBac-Luc感染BmN细胞示例的结果，统 计结果表明不同浓度M0CD处理细胞均可W提高巧光素酶表达量，W0.25mM处理效果最为明 显，在用M0I = 1剂量感染中，处理比对照的活性提高了799%，达到极显著水平，其它处理也 都达到极显著水平(P<〇.01);在用M0I = 0.1剂量感染中与处理比对照的活性提高了 532%， 达到极显著水平(P<0.01)，其它不同剂量病毒感染都达到显著(0.125mM，P<0.05)与极显著 效果(P<〇.〇l)。
[0047] 最后应当说明的是：W上所述的实施例和实施方式中所述M0CD浓度和处理时间仅 用于说明性目的而非限制，但本领域的普通技术人员应当理解，在细胞状态，培养方式(悬 浮培养及贴壁培养），细胞培养基种类（了(：100,6'日。日'3,5。90011 8。1，6邱'日33['^〇友.5尸1 等）、培养基理化性质等（比如酸碱度等)微小的差异，W及细胞类型(如化5等），可W在形式 上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和 范围，并被包括在本申请的精神和范围之内；同时也包含其它杆状病毒及在病毒入侵中依 赖于胆固醇的其它囊膜病毒，也被包括在本申请的精神和范围之内。
【主权项】
1. 甲基-β-环糊精在提高昆虫杆状病毒表达系统外源蛋白表达量中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述昆虫杆状病毒为AcMNPV病毒或BmNPV病 毒。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述表达系统为8€21、8€9、把811行代(沿5) 或BmN细胞。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述表达系统为贴壁培养及悬浮培养的细 胞。5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述甲基-β_环糊精的工作浓度为0.125-2mM〇6. 甲基-β-环糊精在提高昆虫杆状病毒入侵宿主细胞的效率的应用。7. -种提高昆虫杆状病毒表达系统外源蛋白表达量的组合物，其特征在于有效成分包 括甲基-β-环糊精。
【文档编号】C12N15/866GK106047932SQ201610383426
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】黄金山, 郝碧芳, 南文斌, 柳林, 沈兴家
【申请人】江苏科技大学