在奶中产生外源蛋白的转基因哺乳动物的制作方法

专利名称：在奶中产生外源蛋白的转基因哺乳动物的制作方法
在奶中产生外源蛋白的转基因哺乳动物
背景技术：
在过去十年中已经由制药工业通过提取或通过重组技术来普遍地生产人保健中 所涉及的蛋白因子和激素。涉及所需基因的遗传构建体在细菌、酵母或哺乳动物细胞系中 成功地得到了表达。然而，使用哺乳动物细胞培养物来获得复杂蛋白质，如需要适当糖基化 模式的那些，涉及高成本的方法。在过去十年间已经日益增长地使用重组DNA技术来生产商业上重要的生物材料。 为此，已经克隆了编码各种医学上重要的人蛋白质的DNA序列。这些包括胰岛素、纤溶酶原 激活剂、a 1-抗胰蛋白酶和凝固因子VIII和IX。目前，即使使用新兴的重组DNA技术，通 常也从血液和组织中纯化这些蛋白质，这是昂贵而费时的方法，可能带有传播传感因子如 导致AIDS和肝炎的那些的风险。尽管在细菌中表达DNA序列来生产所需的医学上重要的蛋白质看起来是有吸引 力的提议，但实际上细菌作为宿主常常证明是不能令人满意的，因为外源蛋白在细菌细胞 中不稳定并且没有被正确地加工。认识到这个问题，已经尝试了在哺乳动物组织培养物中表达所克隆的基因并已经 在一些情况下证明了是可行的策略。然而，动物细胞的批量发酵是昂贵的且需要技术的过程。因此存在对用于生产生物物质如正确修饰的真核多肽的高产率，低成本方法的需 要。在这种方法中不存在对人具传染性的因子将是一个优势。为了在奶中获得大量的人蛋白质，获得所需基因的转基因动物如牛的可能性已经 引起了工业的极大兴趣。文献中的几个小组报道了他们生产人血清清蛋白、a抗胰蛋白酶 的成功以及在转基因奶牛或山羊中的一些其它实例。之前已经在小鼠或大鼠中进行了许多实验，将转基因表达限制于乳腺中往往是优 选的，因为使用0酪蛋白或乳清蛋白启动子，其只响应哺乳期雌性中的乳腺转录因子。专门在奶中表达异源蛋白意欲避免对宿主哺乳动物健康的不利影响并提供容易 的纯化方法。在细菌或细胞培养物中表达异源蛋白可能由于该重组蛋白对宿主哺乳动物的毒 性作用而受到阻碍或阻止。在文献中可以找到许多实例，其中在特定的系统中不能表达某 种蛋白，甚至是天然非毒性的蛋白，因为它对宿主是有害的，甚至引起宿主的死亡。死亡的 原因可能是细胞内的高浓度蛋白，高浓度的分泌蛋白或与该蛋白的特异性相互作用和在外 源宿主中引起细胞病变活性的一些细胞成分。已经研发了几种方法来克服这些缺陷，以实现毒性蛋白的异源基因表达，包括使 用融合蛋白，修饰原始蛋白序列，分开表达蛋白的不同多肽等。(参见，Protein Expression and Purification(蛋白表达和纯化)，2001 年 8 月，22(3) :422_9)。在转基因牛中表达重组蛋白时，可以产生相似的作用。在转基因哺乳动物的产生 中，将细胞转染以获得携带目标外源基因的转基因克隆，然后将其用于产生转基因哺乳动 物。该方法通常导致该目标序列插入到宿主基因组中，如果使用特异性的启动子，这是随后应当导致异源蛋白在靶组织或腺体中表达的事件，或如果使用通用启动子，将导致全身表达。蛋白表达的水平将取决于多种因素，包括基因组内插入发生的位置。即使当通过组织特异性启动子指导基因表达时，使用几种蛋白，在许多不同哺乳 动物物种中，已经观察到外源蛋白渗漏至外周循环系统中(参见Life Sciences, 2006年1 月 25 日；78(9) :1003-9，Epub2005 年 9 月 15 日；和 Journal of Biotechnology，2006年 7 月13日；124(2) =469-72, Epub 2006年5月23日)。根据表达的水平、渗漏的水平、异源 蛋白的性质、物种(宿主和外源蛋白)之间的关系和异源蛋白与宿主受体相互作用的能力， 这种渗漏可能具有相关的生物学后果。鉴于与宿主同源蛋白的相似性，这些通过转基因表 达的蛋白中的一些可以对外源宿主发挥其天然的生物活性并可以引起能导致哺乳动物死 亡的病理作用(参见，Endocrinology 1997年7月；138 (7) =2849-55) 0此外，可能的是异 源蛋白不是通过与相应同源宿主受体的相互作用影响哺乳动物的健康，而是通过当一些异 源蛋白在细菌中表达时发生的毒性、非特异性作用影响哺乳动物的健康。本发明提供了通常与在转基因哺乳动物中表达对该哺乳动物具有毒性作用的蛋 白相关的缺陷的创新性解决方法。发明概述本发明涉及非人哺乳动物，将其用于生产可能对哺乳动物具有毒性的目标蛋白。 该哺乳动物的特征在于以下的事实其是转基因的，用于在其奶中生产失活形式的目标蛋 白。目标蛋白的失活形式是目标蛋白对表达目标蛋白的非人转基因哺乳动物是没有毒性的 目标蛋白形式。如在此所用的，毒性意指引起严重的伤害或死亡。目标蛋白的失活形式可 以在表达失活形式的目标蛋白的非人转基因哺乳动物中具有一些生物活性；然后，目标蛋 白的失活形式对非人转基因哺乳动物是无毒的(即，哺乳动物没有死亡或没有遭受严重的 伤害)。可以在体外激活失活形式的蛋白。这种失活蛋白，可能是蛋白的非天然物质，可以 是，但不限于，重组修饰的人胰岛素前体。目标蛋白可以是，但不限于，重组人胰岛素。非人 转基因哺乳动物可以是，但不限于，与物种的哺乳动物。本发明进一步涉及提供用于在哺乳动物的乳房细胞中表达失活形式的目标蛋白 的质粒，其中表达通过β酪蛋白启动子来调控。本发明进一步涉及使用非人转基因哺乳动物生产对非人转基因哺乳动物可能有 毒的目标蛋白的方法。通过将蛋白表达为失活蛋白来避免蛋白的潜在毒性。这种失活蛋白， 可能是蛋白的非天然物质，可以是，但不限于，修饰的人胰岛素前体。目标蛋白可以是，但不 限于，重组人胰岛素。非人转基因哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的哺乳动物。本发明还涉及生产重组胰岛素的方法，包括制备非人转基因哺乳动物，该转基因 动物在其奶中产生重组的修饰胰岛素前体，从非人转基因哺乳动物获得奶，从奶中纯化前 体，将纯化的前体接受酶切割和转肽作用，以产生重组胰岛素，并将重组胰岛素纯化。重组 胰岛素可以是，但不限于，重组人胰岛素。转基因哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的哺乳 动物。附图简述

图1显示了表达质粒ρ β mhuIP的略图，其含有编码修饰的人胰岛素前体(mhuIP) 的基因序列和指导其表达至乳房细胞中的启动子。图2显示了起始构建体的略图，其含有编码mhuIP的序列。
图3显示了表达质粒pNJK IP的略图，其含有编码修饰的人胰岛素前体(mhuIP) 的基因序列，指导其表达至乳房细胞中的启动子和鸡β球蛋白绝缘子的编码序列的片段。图4显示了表达质粒ρ β KLE IP的略图，其含有编码修饰的人胰岛素前体(mhuIP) 的基因序列，指导其表达至乳房细胞中的启动子，牛α乳清蛋白基因的编码序列的大部分 和肠激酶切割位点。发明详述本发明涉及用于生产对哺乳动物可能有毒的目标蛋白的非人哺乳动物。该哺乳动 物的特征在于以下事实其是转基因的，用于在其奶中生产失活形式的目标蛋白。术语失活 蛋白指的是目标蛋白对表达目标蛋白的非人转基因哺乳动物为无毒的形式。在本发明进一 步的实施方案中，术语失活蛋白指的是没有进一步翻译后修饰而缺乏生物活性的蛋白。失 活蛋白的实例包括前体蛋白(即，前肽)，含有修饰(即，与天然蛋白相比时，氨基酸的取代、 添加或缺失)的蛋白，该修饰使得蛋白质在生物上失活，而没有进一步加工，或修饰的前体 蛋白(即，与天然前肽相比时含有氨基酸取代、添加或缺失的前肽)。换句话说，通过将蛋白 表达为没有杀灭表达目标蛋白的非人转基因哺乳动物的失活蛋白来避免目标蛋白的潜在 毒性。这种失活蛋白，可能是蛋白的非天然物质，可以是，但不限于，以下的前体、修饰前体 或修饰形式抗体、激素、生长因子、酶、凝血因子、阿朴脂蛋白、受体、药品、药物、生物药品、 保健食品、致癌基因、肿瘤抗原、肿瘤抑制剂、细胞因子、病毒抗原、寄生虫抗原和细菌抗原。 优选，失活蛋白是不会在表达修饰的胰岛素前体的非人转基因哺乳动物中引起低血糖的重 组修饰的胰岛素前体。更优选，失活蛋白是重组修饰的胰岛素前体，最优选，是重组修饰的 人胰岛素前体。目标蛋白可以是，但不限于，重组胰岛素，更优选，重组哺乳动物胰岛素，最 优选，重组人胰岛素。该非人哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的哺乳动物。转基因哺乳 动物的其他物种可以是，但不限于，猪物种、绵羊物种、公山羊物种或啮齿动物物种。胰岛素是负责控制体内葡萄糖的转运、利用和贮存的主要激素。胰腺的β细胞分 泌胰岛素的单链前体，称为胰岛素原。胰岛素原由三个结构域组成氨基端B链，羧基端A 链和中间称为C肽的连接肽。胰岛素原的蛋白水解导致胰岛素原链中某些碱性氨基酸连同 连接肽(C肽)的去除，以产生生物活性的多肽胰岛素。在实施方案中，修饰蛋白为不是蛋白天然存在形式的蛋白质形式。在实施方案中， 修饰的胰岛素前体含有氨基端B链和羧基端A链。然而，修饰的胰岛素前体含有修饰的C 肽。在修饰的胰岛素前体中，编码在天然存在的胰岛素原中发现的连接C肽的氨基酸由未 在天然存在的胰岛素原中发现的氨基酸替代。在实施方案中，修饰的C肽含有以下三个氨 基酸:Ala-Ala-LyS。此外，修饰的胰岛素前体可以含有修饰的B链。在实施方案中，修饰的 B链含有天然存在的B链几乎所有的C-端氨基酸。在进一步的实施方案中，修饰的胰岛素前体是由53个氨基酸组成的修饰人胰岛 素前体，分子量约为6kD。修饰的人胰岛素前体含有具有天然存在B链氨基酸1-29的修饰B 链和具有三个氨基酸Ala-Ala-Lys的修饰C肽。可以将修饰的人胰岛素前体接受酶切割和 转肽作用，以产生人胰岛素，这对于糖尿病的治疗是必需的，并且其应用也是非常确定的。本发明还涉及转基因的用于在其奶中生产重组修饰的人胰岛素前体的非人哺乳 动物，其特征在于以下的事实重组修饰的人胰岛素前体没有使哺乳动物不能生存。本发明进一步涉及用于生产重组人胰岛素的牛物种的转基因哺乳动物。已知人胰岛素在牛中是有活性的。预期表达成熟形式的人胰岛素的牛可能呈现出与低血糖相关的症 状，因为转基因蛋白可以渗漏至血流中。因此，表达重组人胰岛素的转基因牛可能是不能生 存的。然而，本发明克服了这种缺陷，并使得可以在转基因哺乳动物中表达可能对转基因哺 乳动物有毒的蛋白。本发明表达失活形式的目标蛋白。从转基因哺乳动物的奶中纯化失活 蛋白，并在体外转化成蛋白的成熟(即，活性)形式。勿庸置疑地，哺乳动物，如牛，将其用 作生产表达时对哺乳动物有害的治疗蛋白(例如，人胰岛素)的工具构成了出乎意料的和 创新性的贡献。本发明进一步涉及在其奶中产生重组修饰的胰岛素前体的非人转基因哺乳动物，其基因组包含整合的质粒，该质粒包含编码修饰的胰岛素前体的核酸，该核酸可操作地连 接指导该序列在哺乳动物的乳房细胞中表达的启动子。非人哺乳动物可以是，但不限于，牛 物种的哺乳动物。转基因哺乳动物的其他物种可以是，但不限于，猪物种、绵羊物种、公山羊 物种或啮齿动物物种。修饰的胰岛素前体可以是修饰的哺乳动物胰岛素前体，更优选，修饰 的人胰岛素前体，修饰的牛胰岛素前体，修饰的猪胰岛素前体，修饰的绵羊胰岛素前体，修 饰的公山羊胰岛素前体，修饰的啮齿动物胰岛素前体，最优选，修饰的人胰岛素前体。启动 子可以是β酪蛋白启动子。合适的β酪蛋白启动子包括，但不限于，牛β酪蛋白启动子 或公山羊β酪蛋白启动子。其他β酪蛋白启动子包括，但不限于，猪β酪蛋白启动子，绵 羊β酪蛋白启动子或啮齿动物β酪蛋白启动子。整合的质粒还可以含有抗生素抗性基因， 如新霉素抗性基因。此外，整合的质粒可以是ρβιΛιιΙΡ。整合的质粒还可以是pNJK IP或 ρ β KLE IP。本发明进一步涉及非人转基因哺乳动物，其中在哺乳动物的体细胞和生殖细胞中 都发现了上述的整合质粒。本发明进一步涉及在其奶中产生重组修饰的人胰岛素前体的牛物种的非人转基 因哺乳动物，其基因组包含整合的质粒，该质粒包含编码修饰的人胰岛素前体的核酸和指 导该序列在哺乳动物的乳房细胞中表达的β酪蛋白启动子。合适的β酪蛋白启动子包括， 但不限于，牛β酪蛋白启动子或公山羊β酪蛋白启动子。其他β酪蛋白启动子包括，但 不限于，猪β酪蛋白启动子，绵羊β酪蛋白启动子或啮齿动物β酪蛋白启动子。整合的 质粒还可以含有抗生素抗性基因，如新霉素抗性基因。此外，整合的质粒可以是ρβπ ιιΙΡ。 整合的质粒还可以是pNJKIP或ρβΚΙ IP。本发明还涉及包含编码修饰的胰岛素前体的核酸序列和抗性基因的质粒，该核酸 序列可操作地连接β酪蛋白启动子，该抗性基因使得可以选择抗生素抗性细胞。合适的β 酪蛋白启动子包括，但不限于，牛β酪蛋白启动子或公山羊β酪蛋白启动子。其他β酪蛋 白启动子包括，但不限于，猪β酪蛋白启动子，绵羊β酪蛋白启动子或啮齿动物β酪蛋白 启动子。在实施方案中，抗生素抗性基因是新霉素抗性基因，其使得可以选择遗传霉素抗性 细胞。这样的质粒的实例是ρβιΛιιΙΡ，如图1中所示。这样的质粒的其他实例是pNJK IP, 如图3中所示，和ρ β KLE IP，如图4中所示。本发明进一步涉及包含编码修饰的胰岛素前体的核酸序列的质粒，其中修饰的胰 岛素前体是修饰的哺乳动物胰岛素前体。修饰的哺乳动物胰岛素前体可以是修饰的人胰岛 素前体，修饰的牛胰岛素前体，修饰的猪胰岛素前体，修饰的绵羊胰岛素前体，修饰的公山 羊胰岛素前体或修饰的啮齿动物胰岛素前体。在实施方案中，修饰的哺乳动物胰岛素前体是修饰的人胰岛素前体。本发明进一步涉及包含编码修饰的胰岛素前体的核酸序列的质粒，该修饰的胰岛素前体不会在表达修饰的胰岛素前体的非人转基因哺乳动物中引起低血糖。本发明进一步涉及包含编码含有修饰C肽的修饰人胰岛素前体的核酸序列的质 粒。在修饰的人胰岛素前体中，编码在天然存在的人胰岛素原中发现的连接C肽的氨基酸 由未在天然存在的胰岛素原中发现的氨基酸替代。在实施方案中，修饰的C肽含有以下三 个氨基酸Ala-Ala-LyS。此外，修饰的人胰岛素前体可以含有修饰的B链。在实施方案中， 修饰的B链含有天然存在的B链的氨基酸1-29。本发明进一步涉及包含编码修饰的胰岛素前体的核酸序列的质粒，其进一步包含 一个或多个其他遗传元件，这些遗传元件将增强质粒稳定性，增强从质粒转录的mRNA的稳 定性，降低修饰的胰岛素前体的降解和/或提高修饰的胰岛素前体的表达。合适的遗传元 件包括，但不限于，调控元件(例如，启动子、增强子、绝缘子或转录终止位点)、不是胰岛素 基因编码序列的片段或不是胰岛素基因的编码序列。在实施方案中，遗传元件是鸡β球蛋 白绝缘子的编码序列的片段。这样的质粒的实例是PNJK IP，如图3中所示的。在其他实施 方案中，遗传元件是牛α乳清蛋白基因的编码序列的片段。这样的质粒的实例是P β KLE IP，如图4中所示的。依据布达佩斯条约的条款将质粒ρ β mhuIP、pNJK IP和ρ β KLE IP保藏。保藏的 名禾尔禾口地址是 DSMZ-Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B，D_38134Braunschweig，德国。ρ β mhu IP 在 2008 年 4 月 4 日保藏于 DSMZ， 并给予DSMZ保藏号DSM 21359。pNJK IP在2008年4月4日保藏于DSMZ，并给予DSMZ保 藏号 DSM 21360。p^KLE IP 在 2008 年 6 月 12 日保藏于 DSMZ。本发明进一步涉及转染上述遗传构建体的方法。在实施方案中，通过将遗传构建 体插入脂质体中并将脂质体接触哺乳动物细胞来将上述遗传构建体转染至哺乳动物细胞 中。脂质体可以是阳离子脂质。在合适的介质中新霉素抗性细胞的选择方法是本领域技术人员已知的。必需小心 挑选这样的细胞，以便避免细胞损伤。本发明还涉及将停止于Gtl或细胞周期不同时间的细胞核移植至上核哺乳动物卵 母细胞，最优选牛卵母细胞中的方法。本发明涉及将转基因胚胎移植至激素刺激的哺乳动物子宫，最优选奶牛的子宫中 的方法。本发明进一步涉及制造非人转基因哺乳动物的方法，包括将编码失活目标蛋白的 核酸序列克隆至质粒中，借此将该序列可操作地连接至指导该序列在乳房细胞中表达的启 动子，形成表达质粒；用该表达质粒转染体细胞使得将质粒掺入到细胞的基因组中，形成转 基因体细胞；将成熟卵母细胞去核，形成去核的卵母细胞；将一个转基因体细胞与去核的 卵母细胞融合形成单细胞胚胎；将胚胎植入受体哺乳动物的子宫中；并监视妊娠直到转基 因哺乳动物的出生。目标失活蛋白可以是没有在哺乳动物中引起低血糖的修饰胰岛素前 体。修饰的胰岛素前体优选是修饰的哺乳动物胰岛素前体，更优选，修饰的人胰岛素前体， 修饰的牛胰岛素前体，修饰的猪胰岛素前体，修饰的绵羊胰岛素前体，修饰的公山羊胰岛素 前体或修饰的啮齿动物胰岛素前体，并且最优选，修饰的人胰岛素前体。非人转基因哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的哺乳动物。转基因哺乳动物的其他物种可以是，但不限于，猪 物种，绵羊物种，公山羊物种或啮齿动物物种。启动子可以是β酪蛋白启动子。合适的β 酪蛋白启动子包括，但不限于，牛β酪蛋白启动子或公山羊β酪蛋白启动子。其他β酪蛋 白启动子包括，限于，猪β酪蛋白启动子，绵羊β酪蛋白启动子或啮齿动物β酪蛋白启动 子。质粒还可以含有抗生素抗性基因，如新霉素抗性基因。此外，表达质粒可以是P β mhuIP。 表达质粒还可以是pNJK IP或ρβ KLE IP。本发明进一步涉及表达失活形式目标蛋白的非人转基因哺乳动物的制备方法，该 转基因哺乳动物包含编码含有修饰C肽的修饰胰岛素前体的核酸序列。在修饰的胰岛素前 体中，编码在天然存在的胰岛素原中发现的连接C肽的氨基酸由未在天然存在的胰岛素原 中发现的氨基酸替代。在实施方案中，修饰的C肽含有以下三个氨基酸Ala-Ala-Lys。此 夕卜，修饰的人胰岛素前体可以含有修饰的B链。在实施方案中，修饰的B链含有天然存在的 B链的几乎所有C-端氨基酸。本发明进一步涉及表达失活形式目标蛋白的非人转基因哺乳动物的制备方法，其 中体细胞可以是成纤维细胞。此外，转基因体细胞可以分离自在其奶中表达失活形式目标 蛋白的雌性转基因动物。转基因体细胞可以是成纤维细胞。本发明进一步涉及表达失活形式目标蛋白的非人转基因哺乳动物的制备方法，其 中编码失活形式目标蛋白的核酸序列在哺乳动物的体细胞和生殖细胞中都有发现。本发明进一步涉及在其奶中产生重组修饰人胰岛素前体的非人牛物种转基因哺 乳动物的制备方法，其基因组包含整合的质粒，该质粒包含编码修饰人胰岛素前体的核酸 序列和指导该序列在哺乳动物的乳房细胞中表达的β酪蛋白启动子。合适的β酪蛋白启 动子如上所述。整合的质粒可以含有抗生素抗性基因，如新霉素抗性基因。此外，整合的实 例可以是pPmhuIP。整合的质粒还可以是pNJK IP或ρβΚΙ ΙΡ。本发明进一步涉及生产失活形式的目标蛋白的方法，包括制备在其奶中产生失活 形式目标蛋白的非人转基因哺乳动物；从非人转基因哺乳动物获得奶；从奶中纯化失活蛋 白；在体外转换目标蛋白的失活形式；和纯化目标蛋白，其中目标蛋白对非人转基因哺乳 动物可能是有毒的。失活蛋白可以是，但不限于，以下的前体、修饰前体或修饰形式抗体、 激素、生长因子、酶、凝血因子、阿朴脂蛋白、受体、药品、药物、生物药、营养补给品、致癌基 因、肿瘤抗原、肿瘤抑制剂、细胞因子、病毒抗原、寄生虫抗原和细菌抗原。优选，失活蛋白可 以是重组修饰的胰岛素前体，更优选，重组修饰的哺乳动物胰岛素，最优选，重组修饰的人 胰岛素前体。非人哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的哺乳动物。转基因哺乳动物的其他 物种可以是，但不限于，猪物种、绵羊物种、公山羊物种或啮齿动物物种。本发明还涉及在非人转基因哺乳动物中生产失活形式目标蛋白的方法，该转基因 哺乳动物是通过以下方法制得的该方法包括将编码失活形式目标蛋白的核酸序列克隆至 质粒中，借此将该序列可操作地连接至指导该序列在乳房细胞中表达的启动子，形成表达 质粒；用质粒转染体细胞，任选成纤维细胞，使得将质粒掺入到体细胞的基因组中，形成转 基因体细胞；将成熟卵母细胞去核，形成去核的卵母细胞；将一个转基因体细胞与去核的 卵母细胞融合形成单细胞胚胎；将胚胎植入受体哺乳动物的子宫中；并监视妊娠直到转基 因哺乳动物的出生。目标失活蛋白可以是没有在哺乳动物中引起低血糖的修饰胰岛素前 体。修饰的胰岛素前体优选是修饰的哺乳动物胰岛素前体，更优选，修饰的人胰岛素前体，修饰的牛胰岛素前体，修饰的猪胰岛素前体，修饰的绵羊胰岛素前体，修饰的公山羊胰岛素 前体或修饰的啮齿动物胰岛素前体，并且最优选，修饰的人胰岛素前体。非人转基因哺乳动 物可以是，但不限于，牛物种的哺乳动物。转基因哺乳动物的其他物种可以是，但不限于，猪 物种，绵羊物种，公山羊物种或啮齿动物物种。启动子可以是β酪蛋白启动子。合适的β 酪蛋白启动子如上所述。质粒还可以含有抗生素抗性基因，如新霉素抗性基因。此外，表 达质粒可以是P β mhuIP。质粒还可以包含一个或多个其他遗传元件，这些遗传元件将增强 质粒稳定性，增强从质粒转录的mRNA的稳定性，降低修饰的胰岛素前体的降解和/或提高 修饰的胰岛素前体的表达。合适的遗传元件包括，但不限于，调控元件(例如，启动子、增强 子、绝缘子或转录终止位点)、不是目标蛋白基因编码序列的片段或不是目标蛋白基因的编 码序列。表达质粒可以是PNJK IP或ρβ KLE IP。
在实施方案中，使用编码含有修饰C肽的修饰胰岛素前体的核酸序列来克隆表达 失活形式目标蛋白的非人转基因哺乳动物。在修饰的胰岛素前体中，编码在天然存在的胰 岛素原中发现的连接C肽的氨基酸由未在天然存在的胰岛素原中发现的氨基酸替代。在实 施方案中，修饰的C肽含有以下三个氨基酸:Ala-Ala-LyS。此外，修饰的胰岛素前体可以含 有修饰的B链。在实施方案中，修饰的B链含有天然存在B链的几乎所有的C-端氨基酸。在进一步的实施方案中，通过其中体细胞是成纤维细胞的方法制得表达失活形式 目标蛋白的非人转基因哺乳动物。此外，转基因体细胞可以分离自在其奶中表达失活形式 目标蛋白的雌性转基因动物。转基因体细胞可以是成纤维细胞。在进一步的实施方案中，表达失活形式目标蛋白的核酸序列在表达失活形式目标 蛋白的非人转基因哺乳动物的体细胞和生殖细胞中都有发现。本发明进一步涉及在其奶中产生重组修饰人胰岛素前体的非人转基因哺乳动物 中生产失活形式人胰岛素的方法，其基因组包含整合的质粒，该质粒包含编码修饰的人胰 岛素前体的核酸序列和指导该序列在哺乳动物的乳房细胞中表达的β酪蛋白启动子。合 适的β酪蛋白启动子如上所述。整合的质粒可以含有抗生素抗性基因，如新霉素抗性基 因。此外，整合质粒可以是ρβιΛιιΙΡ。整合质粒还可以包含一个或多个其他遗传元件，这些 遗传元件将增强质粒稳定性，增强从质粒转录的mRNA的稳定性，降低修饰的胰岛素前体的 降解和/或提高修饰的胰岛素前体的表达。合适的遗传元件包括，但不限于，调控元件(例 如，启动子、增强子、绝缘子或转录终止位点)、不是胰岛素基因编码序列的片段或不是胰岛 素基因的编码序列。整合质粒可以是PNJK IP或ρβ KLE IP。此外，本发明涉及从在其奶中产生失活蛋白的转基因哺乳动物的奶中纯化失活形 式目标蛋白的方法。纯化方法可以包括色谱和过滤步骤。可以使用不同类型的色谱，并包 括离子交换色谱或反相色谱。离子交换色谱可以是阳离子交换色谱。此外，可以进行多个 色谱步骤。本发明进一步涉及从在其奶中产生失活蛋白的非人转基因哺乳动物的奶中纯化 失活形式目标蛋白的方法，包括从非人转基因哺乳动物获得奶，将非人转基因哺乳动物的 奶澄清，获得澄清的奶，并使澄清的奶接受色谱，获得纯失活蛋白。色谱步骤可以包括离子 交换色谱或反相色谱。反相色谱可以使用反相基质，如C4或C18反相基质。此外，可以进 行多个色谱步骤。本发明进一步涉及从在其奶中产生失活蛋白的非人转基因哺乳动物的奶中纯化失活形式目标蛋白的方法，包括从非人转基因哺乳动物获得奶，将非人转基因哺乳动物的 奶澄清，获得澄清的奶，并使澄清的奶接受阳离子交换色谱，获得阳离子交换色谱处理过的 材料，使阳离子交换色谱处理过的材料接受反相色谱，获得纯失活蛋白。本发明的失活蛋白可以是重组的修饰胰岛素前体，优选，重组修饰的哺乳动物胰 岛素前体，更优选，重组修饰的人胰岛素前体，重组修饰的牛胰岛素前体，重组修饰的猪胰 岛素前体，重组修饰的绵羊胰岛素前体，重组修饰的公山羊胰岛素前体或重组修饰的啮齿 动物胰岛素前体，并最优选，重组修饰的人胰岛素前体。此外，修饰的胰岛素前体没有在表 达修饰胰岛素前体的非人转基因哺乳动物中引起低血糖。在修饰的胰岛素前体中，编码在 天然存在的胰岛素原中发现的连接C肽的氨基酸由未在天然存在的胰岛素原中发现的氨 基酸替代。在实施方案中，修饰的c肽含有以下三个氨基酸:Ala-Ala-LyS。此外，修饰的胰 岛素前体可以含有修饰的B链。在实施方案中，修饰的B链含有天然存在B链的几乎所有 的C-端氨基酸。非人哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的哺乳动物。转基因哺乳动物的 其他物种可以是，但不限于，猪物种、绵羊物种、公山羊物种或啮齿动物物种。本发明进一步涉及将失活形式的目标蛋白转化成成熟(即，活性)形式目标蛋白 的方法，然后纯化目标蛋白。转化可以包括目标蛋白前体的酶切割。酶切割可以涉及胰蛋 白酶水解(trypsinolysis)。目标蛋白的纯化可以包括色谱步骤。这些色谱步骤可以包括 反相色谱。反相色谱可以使用反相基质，C4或C18反相基质。此外，可以进行多个色谱步 马聚o本发明进一步涉及将重组修饰的胰岛素前体转化成重组胰岛素的方法，然后纯化 重组胰岛素。转化可以包括重组修饰的胰岛素前体的酶切割和转肽作用。酶切割可以涉及 胰蛋白酶水解。重组胰岛素的纯化可以包括色谱步骤。这些色谱步骤可以包括反相色谱或 离子交换色谱。此外，可以进行多个色谱步骤。本发明还涉及将重组修饰的胰岛素前体转化成重组胰岛素的方法，然后纯化重组 胰岛素。该方法包括使重组修饰的胰岛素前体接受胰蛋白酶水解和转肽作用，形成胰蛋白 酶水解和转肽的材料，使胰蛋白酶水解和转肽的材料接受第一个反相色谱，形成第一个反 相色谱处理过的材料，使第一个反相色谱处理过的材料接受第二个反相色谱，形成第二个 反相色谱处理过的材料，并使第二个反相色谱处理过的材料接受第三个反相色谱，形成纯 的重组胰岛素。反相色谱的步骤包括使用反相基质，优选C4或C18反相基质。重组胰岛素和重组修饰的胰岛素前体可以分别是，重组哺乳动物胰岛素和重组修 饰的哺乳动物胰岛素前体，更优选，各自为重组人胰岛素和重组修饰的人胰岛素前体，重组 牛胰岛素和重组修饰的牛胰岛素前体，重组猪胰岛素和重组修饰的猪胰岛素前体，重组绵 羊胰岛素和重组修饰的绵羊胰岛素，重组公山羊胰岛素和重组修饰的公山羊胰岛素，或重 组啮齿动物胰岛素和重组修饰的啮齿动物胰岛素前体，最优选，重组人胰岛素和重组修饰 的人胰岛素前体。此外，修饰的胰岛素前体不会在表达修饰胰岛素前体的非人转基因哺乳 动物中引起低血糖。在修饰的胰岛素前体中，编码在天然存在的胰岛素原中发现的连接C 肽的氨基酸由未在天然存在的胰岛素原中发现的氨基酸替代。在实施方案中，修饰的C肽 含有以下三个氨基酸:Ala-Ala-LyS。此外，修饰的胰岛素前体可以含有修饰的B链。在实 施方案中，修饰的B链含有天然存在B链的几乎所有的C-端氨基酸。本发明进一步涉及生产目标蛋白的方法，包括制备在其奶中产生失活形式目标蛋白的非人转基因哺乳动物，从非人转基因哺乳动物获得奶，从奶纯化失活蛋白，通过将纯化 的失活蛋白接受酶切割在体外转化失活蛋白，并最终纯化目标蛋白。本发明进一步涉及生产重组胰岛素的方法，包括制备在其奶中产生重组修饰的胰 岛素前体的非人转基因哺乳动物，从非人转基因哺乳动物获得奶，从奶纯化重组修饰的胰 岛素前体，通过使纯化的前体接受酶切割和转肽作用在体外将前体转化成重组胰岛素，并 最终纯化重组胰岛素。此外，本发明还涉及生产重组胰岛素的方法，包括制备在其奶中产生重组修饰的 胰岛素前体的非人转基因哺乳动物，从非人转基因哺乳动物获得奶，将奶澄清，获得澄清的 奶，使澄清的奶接受阳离子交换色谱，获得阳离子交换色谱处理过的材料，使阳离子交换色 谱处理过的材料接受反相色谱，形成纯的重组修饰的胰岛素前体，使纯的重组修饰的胰岛 素前体接受胰蛋白酶水解和转肽作用，获得胰蛋白酶水解和转肽的材料，使胰蛋白酶水解 和转肽的材料接受第一个反相色谱，形成第一个反相色谱处理过的材料，使第一个反相色 谱处理过的材料接受第二个反相色谱，形成第二个反相色谱处理过的材料，并使第二个反 相色谱处理过的材料接受第三个反相色谱，形成纯的重组胰岛素。重组胰岛素和重组修饰的胰岛素前体各自可以是，重组哺乳动物胰岛素和重组修 饰的哺乳动物胰岛素前体，更优选，各自为重组人胰岛素和重组修饰的人胰岛素前体，重组 牛胰岛素和重组修饰的牛胰岛素前体，重组猪胰岛素和重组修饰的猪胰岛素前体，重组绵 羊胰岛素和重组修饰的绵羊胰岛素，重组公山羊胰岛素和重组修饰的公山羊胰岛素，或重 组啮齿动物胰岛素和重组修饰的啮齿动物胰岛素前体，最优选，重组人胰岛素和重组修饰 的人胰岛素前体。非人哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的哺乳动物。转基因哺乳动物的 其他物种可以是，但不限于，猪物种、绵羊物种、公山羊物种或啮齿动物物种。反相色谱的步 骤包括使用反相基质，优选C4或C18反相基质。以下实施例是本发明的各个方面和特征的说明，而非限制。实施例1表达质粒的构建产生了构建体，其含有大部分的牛0酪蛋白基因启动子，包括5’非-编码日酪 蛋白基因区的短片段，与修饰的人胰岛素前体的编码序列融合。短的非翻译片段是0酪蛋 白基因的第一个外显子的片段。所用的0酪蛋白基因为约3.8kb。通过将修饰的人胰岛素前体(mhuIP)的编码序列和大部分的牛0酪蛋白基因启 动子基因(对应于来自0酪蛋白基因5’区的3，800bp)插入合适的载体中来进行表达质 粒pPmhuIP的构建(参见图1)。该启动子确保基因在其控制下组织特异性地和发育调控 地表达，在这种情况下为异源修饰的人胰岛素前体。为了转基因细胞的正确选择，在质粒中包括编码新霉素磷酸转移酶的基因。该基 因使得可以用抗生素遗传霉素来选择转基因细胞，并且其在SV40启动子的控制下。其他构建体可以源自用来提高转染细胞选择或DNA整合至牛细胞基因组中的效 率的原始构建体。通过限制酶分析和DNA测序来分析构建体。之前通过荧光抗体识别在乳腺细胞系 中测试了构建体表达mhuIP的能力。以下详细地描述了质粒p 0 mhuIP的制备。
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p日mhuIP的制备形成起始构建，其包括编码mhuIP (含有修饰C肽的人胰岛素原)的序列。mhuIP 与人胰岛素原相似，除了 mhuIP中的C肽比天然存在的胰岛素原中发现的C肽短。图2描绘了起始构建的略图。开始时，可以找到编码牛信号肽的区域，接着是编码 胰岛素B链(缺乏C-端氨基酸)的序列。然后，可以找到编码三个氨基酸的间隔区的区域， Ala-Ala-Lys，其后是编码胰岛素全部A链的序列，最后是编码mRNA polyA的区域。三个氨 基酸间隔区，Ala-Ala-Lys，替代天然存在的胰岛素原中发现的C肽。通过从6个重叠重建mhuIP序列产生了起始构建，6个重叠是含有限制酶Bam HI 和Not I的识别位点的化学合成的寡核苷酸。引物序列如下所示Insl 5 ‘ -ACTGGGATCCATGGCCCTGTGGACACGCCTGCGGCCCCTGCTGGCCCTGCTGGCGCTCTGGCCCCCCCCCCCGGCCCG-3‘Ins2 5 ‘ -CTCCGCACACCAGGTACAGCGCCTCCACCAGGTGGGAGCCACACAGATGCTGGTTG ACGAAGGCGCGGGCCGGGGGGGGG-3‘Ins3 5 ‘ -ACCTGGTGTGCGGAGAGCGCGGCTTCTTCTACACGCCCAAGGCTGCTAAGGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAG-3‘Ins4 5' -GTGTGGGGCTGCCTGCAGGCTGCGTCTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGGTAGAGG GAGCAGATGCTGGTACAGCA-3‘Ins5 5 ‘ -CAGGCAGCCCCACACCCGCCGCCTCCTGCACCGAGAGAGATGGAATAAAGCCCTTGAACCAGCCCTGCTGTGCCGTCTGT-3‘Ins6 5 ‘ -TGACGCGGCCGCAGCGTGGAGAGAGCTGGGAGGGGCTCACAACAGTGCCGGGAAGTGGGGCTTGGCCCAGGGCCCCCAAGACACACAGCAGGCACAGCA-3‘通过PCR进行重建过程。从引物Insl和Ins2 (产物f 12)、Ins3和Ins4 (产物f34) 以及Ins5和Ins6 (产物f56)的混合物产生PCR产物。然后在单个混合物中使用fl2和f34 重叠片段来进行相同的过程，其获得了产物fl4。最终，在含有f56的混合物中在PCR中使 用H4产物，以扩增大约410bp的片段，其含有全长mhuIP (f 16)。一旦获得了片段fl6，将其克隆至合适的载体中，并转化至感受态大肠杆菌细菌细 胞中，用于进一步扩增带有其相应插入片段的克隆载体。载体源自pBKCMV。pBKCMV是获自 Invitrogen Co. (Carlsbad, CA)的表达载体，其编码CMV启动子，新霉素抗性基因和卡那霉 素抗性基因。用3.8kb牛0酪蛋白启动子替代CMV启动子，并使用Bam HI和Not I限制 位点将片段H6克隆至所得到的载体中。扩增后，进行限制测试，以检查克隆的插入片段的同一性。通过测序获得最终的证实。
此后，在4kb的牛0酪蛋白启动子下游的质粒载体中定向插入起始构建体(Bam HI/NotI)。质粒载体还含有新霉素抗性基因。所得到的载体pPmhuIP，其是最终的构建体， 含有0酪蛋白启动子，编码mhuIP的序列和新霉素抗性基因。人胰岛素原由三个结构域组成氨基末端B链(30个氨基酸)，羧基末端A链(21 个氨基酸)和中间称为C肽的连接肽(31个氨基酸)。mhuIP不同于天然存在形式的人胰 岛素原，因为B链的C-端氨基酸已经除去，并且编码C肽的氨基酸已经由通常未在C肽中 发现的三个氨基酸Ala-Ala-Lys替代。在C肽切割后，形成了成熟的人胰岛素，其仅由A链 和B链组成。表达人胰岛素原的转基因哺乳动物是无法生存的，因为宿主肽酶可以切割并 除去C肽，形成成熟的胰岛素。如上所述，非人转基因哺乳动物中成熟人胰岛素的表达可能 杀死哺乳动物，因为成熟的人胰岛素可能渗漏至哺乳动物的血流中。相反，使用pPmhuIP 制得的非人转基因哺乳动物表达修饰的人胰岛素前体，其不会引起转基因哺乳动物产生任 何明显的低血糖并且对转基因哺乳动物是无毒的。不希望受到以下的限制，因为编码修饰 的人胰岛素前体的三个氨基酸间隔区的区域不同于天然存在的人胰岛素原中发现的C肽， 宿主肽酶没有识别和切割三个氨基酸间隔区。因此，修饰的人胰岛素前体保持失活并且没 有在转基因动物中引起低血糖，这是所要求保护的本发明的重要优点。选择克隆，其含有0酪蛋白启动子和正确融合的mhuIP，以在该启动子控制下仅 表达mhuIPo该表达质粒的大小为约8.4kbp。体细胞的转染然后将质粒p 0 mhuIP用于转染体细胞的初级培养物，使用磷酸钙或脂质体方法。 通常将胎牛成纤维细胞用于转染。通过将遗传霉素加入培养物中来选择转染的细胞。2至8周的时间段后，对遗传霉 素有抗性的细胞适于用作供体细胞来获得转基因克隆。通过PCR来分析转染的选择细胞， 以证实细胞含有表达盒。实施例2卵母细胞去核和成熟去核卵母细胞中的中期核移植牛卵母细胞的收集和体外成熟从屠宰场卵巢中吸出牛卵母细胞并使之在TCM-199+5% FCS+3mMHEPES+杀真菌药 中成熟。然后将选定的卵母细胞置于TCM-199+细胞周期蛋白依赖激酶中，在5% C02的气 氛和39°C下20小时。此后，将卵母细胞置于TCM-199+5% FCS+FSH(促卵泡激素)+抗生素 中，在5% C02的气氛和39°C下24小时。通过在含有lmg/ml牛睾丸透明质酸酶的PBS中 涡旋2分钟来将成熟卵母细胞去核。实施例3使用卵丘细胞的核移植去核使用Narishige水压显微操作器和Nikon Diaphot显微镜将卵母细胞机械去 核。用20 iim斜角和尖锐的移液管进行去核。之前用5iig/ml Bisbenzimidine (Hoechst 333421)染料将卵母细胞染色20分钟。通过在紫外线下观察染色的染色体来将中期去核。 在吸入移液管后，测定中期染色体。将转基因体细胞转染至卵周隙中，并与去核卵母细胞紧密相对。融合、激活和胚胎培养将转基因体细胞和去核的卵母细胞人工地排列在融合室中，使得待融合的膜与电 极平行。使用玻璃胚胎操作移液管来进行。使用持续15 ii s的180伏特/cm的一个电脉冲进行融合(BTXElectro细胞操作仪 200)2并用BTX Optimizer-Graphic脉冲分析仪。用于脉冲胚胎的室由安放在玻璃显微镜载 玻片上的相隔0. 5mm的两个0. 5mm不锈钢金属丝电极构成。融合后三小时，通过在TL-HEPES 中与5 P M离子要素一起培养4分钟和在TCM-199中用2mM 6-DMAP培养3小时来诱导激活。然后在5% C02+5% 02+90% N2的气氛下，在S0F培养基中将激活的卵母细胞培养 6. 5天，直到产生胚细胞。此后，将胚胎移植至代孕母牛中。通常，每只受体奶牛非外科手术地移植两个胚细 胞，并且在30-35天时通过超声波检查来确定妊娠。使植入的奶牛正常地经过妊娠直到自然分娩。最后，外科方法(Caesarea)可以用 于分娩。在头48小时期间给新生儿喂养富含Ig的初乳，然后使用合成的食物，之后使用天 然的食物(所有这些食物都不含动物来源的化合物)。^igma Chemical Co. ，St. Louis, M0, USA2BTX Inc.，San Diego, Ca, USA实施例4对转基因小牛进行的测试该实施例中，我们呈现了对特定的转基因小牛所进行测试的完整描述，该转基因 小牛是作为实施例1至3中所述方法的结果而获得的。尽管如此，应当保持清楚的是对作 为其它获得转基因小牛方法的结果而出生的牛可以进行同一套的测定，这些其他方法如转 基因雌性的亚克隆、转基因雌性的超排卵，接着人工授精，或用来自对所需蛋白为转基因的 公牛的精子将转基因或非转基因雌性人工授精。通过对从小牛白细胞中纯化得到的DNA进行PCR反应，使用来自非转基因jersey 小牛的DNA作为负对照，证明了在转基因小牛细胞的基因组中包括牛3酪蛋白启动子和编 码修饰的人胰岛素前体的序列。可以作为不同于小牛的同源3酪蛋白基因的独特DNA片 段一起发现它们。使用Pharmacia自动测序仪，证实了插入的序列对应于克隆质粒中所含的编码修 饰的人胰岛素前体的序列。插入的序列包括分泌信号和终止子。将控制修饰的人胰岛素前 体序列在我们的小牛中表达的牛0酪蛋白启动子也进行了测序。所有那些元件与其预期 的理论序列精确地一致，该理论序列来自用于转化产生了克隆的细胞的遗传构建体。实施例5从奶中纯化重组的mhuIP，将mhuIP转化成人胰岛素和人胰岛素的纯化从转化的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的发酵获得为研发从奶中纯化前 体的程序所需量的重组mhuIP蛋白。为此，在通过甲醇可诱导的启动子的控制下，将编码 mhuIP的序列亚克隆至酵母分泌信号序列下游的表达载体中，并在酵母细胞中转化。此后，进行合适克隆的选择并从选定的克隆制得液体培养物。在含有作为碳源的甘油、少量元素的培养基中进行转化的酵母克隆的发酵。将甲醇用于诱导。该发酵获得0.5克mhuIP/升培养物。一旦发酵结束，进行纯化步骤来获得纯产物。最初的目标是从酵母培养物获得纯的重组mhuIP。因此，用纯水将转化的巴斯德 毕赤酵母培养物的上清液稀释十倍，并使用冰醋酸将其PH调节至3. 0。证实该溶液的传导 率，使得其没有呈现高于7mS/cm的值。此后进行纯化过程，以获得用于研发从转基因哺乳 动物的奶中纯化重组mhuIP的方法的起始材料，并进一步将其转化成重组人胰岛素。首先，使上述溶液接受阳离子交换色谱步骤，使用SP S印haroseFF树脂 (Amersham)，以lOOcm/h的流速。使用5%醋酸进行柱的装载(每mL树脂装载10mL上清 液)和平衡。为了蛋白质的洗脱，使用PH 3的5%醋酸1M NaCl的梯度，在25个柱体积 的总体积中，从100 0的溶液比例开始，直到达到0 100的溶液比例。在第二个纯化步骤中，使来自阳离子交换色谱的洗出液接受反相色谱。用纯水将 之前的洗出液稀释五倍，并用三氟醋酸(TFA)将pH调节至3。将所得到的溶液装载至含有C4Baker Wide Pore树脂的柱中。将流动设定为 lOOcm/h的速率。为了装载和平衡，使用了 0. 的TFA/水。为了洗脱，使用0. 1 % TFA/ 水-乙腈梯度，在50个柱体积的总体积中，从100 0的溶液比例开始，直到达到0 100 的溶液比例。之前纯化步骤的总产率大约为42%，并获得了纯度高于95%的mhuIP。研发了以下的方法，其包括从奶中纯化重组mhuIP(因为转基因哺乳动物将在其 奶中分泌前体)，将重组mhuIP转化成重组人胰岛素和重组人胰岛素的最终纯化。通过将纯 的重组mhuIP (获自巴斯德毕赤酵母，如上所述)与常规牛奶混合来获得用于该研发的起始 材料。研发了彻底的纯化方法。该方法包括以下步骤通过切向过滤获得奶泡，稀释所 获得的洗出液来获得最终保留在酪蛋白胶束中的重组mhuIP更好的溶解度(澄清)；并将 该溶液通过阳离子交换色谱柱。使所得到的溶液接受反相色谱(C4)步骤，此后使富含重组 mhuIP的级分接受胰蛋白酶水解和转肽作用。最后，进行重组人胰岛素的纯化，因为在制造 生物药品时，将目标蛋白纯化至同质性以避免产品中可能污染物的存在是强制性的。用于从奶中纯化重组mhuIP，之后转化成重组人胰岛素和重组人胰岛素最终纯化 的程序包括以下次序的步骤(a)切向流过滤(澄清)，(b)阳离子交换色谱，(c)反相色谱 (C4)，(d)胰蛋白酶分解和转肽作用，(e)反相色谱(C4)，(f)反相色谱(C4)和(g)反相色 谱(C18)。澄清将鲜奶与足量的纯重组mhuIP混合，重组mhuIP如之前所述在巴斯德毕赤酵母 中产生。此后，将产物接受切向流过滤步骤。滤器孔径大小为0.1 ym，并且该方法产率为 80%。阳离子交换色谱对从之前步骤得到的材料进行色谱处理，使用阳离子交换基质。用冰醋酸将待色 谱的溶液的pH调节至3. 0。检查传导率，使其不高于7mS/cm。使用流速为100cm/h的SP Sepharose FF树脂(Amersham)进行色谱步骤。使用 5%醋酸进行柱的装载和平衡。为了蛋白质的洗脱，使用pH 3的5%醋酸1M NaCl的梯度，在25个柱体积的总体积中，从100 0的溶液比例开始，直到达到0 100的溶液比例。色谱步骤具有90%的产率。测定选定的含有重组mhuIP的级分的总蛋白(通过 Bradford方法)和目标蛋白(通过Western印迹)，并贮存于2-8°C。反相色谱(1)然后使从之前步骤得到的材料接受反相色谱，使用C4 Baker WidePore树脂。将 流动设定为lOOcm/h的速率。为了装载和平衡，使用了 0.1%的TFA/水。为了洗脱，使用 0.1%TFA/水-乙腈梯度，在50个柱体积的总体积中，从100 0的溶液比例开始，直到达 到0 100的溶液比例。该步骤具有68%的产率。胰蛋白酶水解和转肽作用用胰蛋白酶处理从之前步骤得到的材料。为了胰蛋白酶水解，用胰蛋白酶(以200iiM的浓度)在12°C下将10mM mhuIP溶
液培养24小时。一旦结束培养，进行转肽反应，以在人胰岛素B链的位置30添加苏氨酸。为此，制 备含有 0. 8M Thr-0bu, 50 % DMF/EtOH (1 1)，26% H20，醋酸，10mM mhuIP 和 200 ii M 胰蛋 白酶的溶液，并使转肽反应进行直到完全。一旦转肽步骤已经结束，使所得到的溶液接受三次连续的反相色谱步骤，以产生 纯的重组人胰岛素。反相色谱(2)使从之前步骤得到的材料接受反相色谱。首先，使用50mM NaH2P04, pH5. 0将之前消化的材料稀释至0. 125mg/mL。此后，加 入50 y L醋酸/100mL溶液。然后样品是清澈的，pH大约为4. 5，并且样品是即可装载的。缓冲液组成如下所述移动相A (MPA) :210mL硫酸盐缓冲液+790mL纯水(大约48mS的传导率)。移动相B (MPB) 105mL硫酸盐缓冲液+40 %乙腈，纯水q. s. p.至1L。1L硫酸盐缓冲液含有132. lgr. NH4S04,14mL H2S04,并且将其pH调节至2. 00。装载后，如下以lOOcm/h的流速进行洗脱首先，使用MPA-MPB梯度，在135mL的 总体积中，从100 0的溶液比例开始，直到达到55 45的溶液比例；此后，使用另一个 MPA-MPB梯度，在360mL的总体积中，从55 45的溶液比例开始，直到达到25 75的溶液 比例；并且最后，使用最终的MPA-MPB梯度，在50mL的总体积中，从25 75的溶液比例开 始，直到达到0 100的溶液比例。所获得的级分含有纯度超过98%的重组人胰岛素，并且该步骤的产率大约为 85%。反相色谱(3)对于该步骤，通过将其pH调节至7. 4，对从之前步骤获得的材料进行调节。然后使用C4 Baker Wide Pore基质对所得到的溶液进行色谱。将流动设定为 lOOcm/h的速率。为了装载和平衡，使用了 0. 的TFA/水。为了洗脱，使用0. 1 % TFA/ 水-乙腈梯度，在50个柱体积的总体积中，从100 0的溶液比例开始，直到达到0 100 的溶液比例。
19
该步骤具有大约65%的产率。反相色谱(4)对于最终的反相色谱步骤，通过将其pH调节至3. 0，对从之前步骤获得的材料进 行调节。然后使用C18反相基质对调节过的材料进行色谱。将流动设定为lOOcm/h的速率。 为了装载和平衡，使用了 0. 1 %的TFA/水。为了洗脱，使用0. 1 % TFA/水-乙腈梯度，在50 个柱体积的总体积中，从100 0的溶液比例开始，直到达到0 100的溶液比例。该步骤具有大约61%的产率。实施例6表达质粒pNJK IP的构建产生了在转基因牛乳腺中中表达mhuIP的备选构建体，其含有大部分的公山羊3 酪蛋白基因启动子，其与鸡0球蛋白绝缘子的编码序列的片段融合。绝缘子是保护启动子 不受邻近调控元件影响的DNA序列元件，邻近的调控序列包括邻近的抑制基因表达的沉默 序列。产生了这种含有鸡0球蛋白绝缘子的备选构建体，以阻断0酪蛋白启动子受任何 邻近沉默序列的抑制。进行了这种备选质粒的构建，首先，通过从pBCl (其是可从Invitrogen Co. (Carlsbad,CA)获得的商业载体)切除15kb片段，其含有鸡0球蛋白绝缘子的2.4kb 片段，3. lkb的公山羊0酪蛋白启动子序列，包括来自公山羊0酪蛋白基因的内含子和非 翻译外显子，内含子和非翻译外显子之间的来自公山羊0酪蛋白基因的Xho I克隆位点， 以及来自3’ 0酪蛋白基因组序列的poly A信号和侧翼区。将该15kb片段克隆至pPmhuIP的主链中。首先，从pPmhuIP切除3.8kb牛3酪 蛋白启动子和mhuIP片段。使用Sal I和Not I限制位点将15kb片段插入该载体中。然 后，将410bp mhuIP H6片段克隆至位于15kb片段中的Xho I克隆位点(在来自公山羊3 酪蛋白基因的内含子和非翻译外显子之间，如上所述)。将所得到的载体(pNJK IP,图3)转化至感受态的大肠杆菌细菌细胞中，用于进一 步扩增含有其对应插入片段的克隆载体。扩增后，进行限制位点分析来检查mhuIP fl6片段插入片段的方向。通过测序获 得最终的证实。实施例7表达质粒p 0 KLEIP的构建产生了在转基因牛乳腺中中表达mhuIP的备选构建体，其含有大部分的牛3酪 蛋白基因启动子，包括0酪蛋白基因的第一个外显子的短的非翻译片段，其与大部分的牛 a乳清蛋白基因的编码序列融合，接着为肠激酶切割位点，其接着为修饰的人胰岛素前体 (mhuIP)的编码序列。该备选构建体表达a乳清蛋白-mhuIP融合蛋白。由于其较大的序 列，该备选构建体应当产生具有较高稳定性的mRNA。此外，因为a乳清蛋白是在牛乳腺中 天然表达的蛋白，该备选构建体应当最小化mhuIP降解和提高mhuIP表达。为了产生该构建体，首先，使用来自牛外周血的白细胞的DNA作为模板来进行PCR 反应，以克隆大部分的a乳清蛋白基因。PCR产物包含约700bp的a乳清蛋白直到第二个 外显子结束，并包括a乳清蛋白信号序列。
第一个PCR反应使用了以下寡核苷酸NES :GGA GGT GAG CAG TGT GGT GACALB :GAA GTT ACT CAC TGT CAC AGG AGA然后，进行了第二个PCR反应，使用以下寡核苷酸SIG :TCA CCA AAA TGA TGT CCT TTG TCLAC :TGT CAC AGG AGA TGT TAC AGA通过该程序，获得了 620bp片段并使用Sma I限制位点克隆至pUC中(pUC a乳清 蛋白)。通过PCR从内部的IP克隆质粒获得带有mhuIP基因的片段，使用以下的寡核苷 酸EKB :tag get age gat gat gat gat aaa ttc gtt aac cag cac ctgCadAr :tca gcg gcc gc tta gtt gca gta gtt所得到的260bp片段包括编码肠激酶识别位点的短序列，该肠激酶识别位点在 mhuIP的编码序列的上游。肠激酶切割位点使得IP可以与剩余的肽分离。然后用Nhel消 化260bp片段并插入pUCa乳清蛋白中相当的Xbal限制位点。选择所得到的构建体，其中 260bp片段位于构建体方向中的a乳清蛋白基因的下游。该构建体具有大部分的牛a乳 清蛋白基因的编码序列，包括a乳清蛋白信号序列，接着是肠激酶识别位点，其进一步接 着修饰的人胰岛素前体(mhuIP)的编码序列。首先用EcoRI消化pUC a乳清蛋白质粒，并用Klenow处理所得到的粘性末端。此 外，进行了 NotI消化并分离所得到的基因片段。在位于所述启动子区域3'端的唯一BamHI 位点中消化带有0酪蛋白启动子的PBK质粒，用于待连接的a乳清蛋白基因融合体。因 此，还将BamHI位点钝化来连接来自该片段的EcoRI钝化端，在给插入片段的NotI端提供 同源末端之前，还进行了 PBK质粒的NotI消化。然后将p 0 KLE IP转化至感受态大肠杆菌细菌细胞中，用于带有其对应插入片段 的克隆载体的进一步扩增。扩增后，通过测序获得最终的证实。现在已经充分地描述了本发明，本领域普通技术人员将会理解可以在宽泛而等价 范围的条件、制剂和其他参数内进行本发明，而不影响本发明或其任何实施方案的范围。在 此引用的所有专利和出版物在此以其整体全部引入作为参考。
权利要求
一种质粒，其包含编码修饰的胰岛素前体的核酸序列，该核酸序列可操作地连接到β酪蛋白启动子上。
2.权利要求1的质粒，其中修饰的胰岛素前体是修饰的哺乳动物胰岛素前体。
3.权利要求2的质粒，其中修饰的哺乳动物胰岛素前体是修饰的人胰岛素前体、修饰 的牛胰岛素前体、修饰的猪胰岛素前体、修饰的绵羊胰岛素前体，修饰的公山羊胰岛素前体 或修饰的啮齿动物胰岛素前体。
4.权利要求3的质粒，其中修饰的哺乳动物胰岛素前体是修饰的人胰岛素前体。
5.权利要求4的质粒，进一步包含抗生素抗性基因。
6.权利要求5的质粒，其中抗生素抗性基因是新霉素抗性基因。
7.权利要求6的质粒，其是p0 mhuIP。
8.质粒pPmhuIP。
9.权利要求6的质粒，进一步包含编码公山羊0酪蛋白启动子的核酸序列和编码鸡 3球蛋白绝缘子片段的核酸序列，包括编码来自公山羊0酪蛋白基因的内含子和非翻译 外显子的核酸序列。
10.权利要求9的质粒，其是pNJKIP。
11.质粒pNJK IP。
12.权利要求6的质粒，进一步包含编码0酪蛋白基因的第一个外显子的非翻译片段 的核酸序列。
13.权利要求12的质粒，进一步包含编码牛a乳清蛋白基因片段的核酸序列和编码肠 激酶切割位点的核酸序列，其在修饰的胰岛素前体的上游。
14.权利要求13的质粒，其是pPKLEIP。
15.质粒p3KLE IP。
16.权利要求1的质粒，其中修饰的胰岛素前体不会在其奶中表达修饰的胰岛素前体 的非人转基因动物中引起低血糖。
17.权利要求16的质粒，其中修饰的胰岛素前体包含修饰的C肽。
18.权利要求17的质粒，其中修饰的C肽包含通常未在天然存在的胰岛素原中发现的氨基酸。
19.权利要求18的质粒，其中修饰的C肽包含以下三个氨基酸Ala-Ala-LyS。
20.权利要求16的质粒，其中修饰的胰岛素前体进一步包含修饰的B链。
21.权利要求20的质粒，其中修饰的B链包含天然存在B链的几乎所有C-端。
22.将权利要求1的质粒转染至哺乳动物细胞中的方法，包括将质粒插入脂质体中，并 使脂质体与哺乳动物细胞接触。
23.权利要求22的将质粒转染至哺乳动物细胞中的方法，其中脂质体是阳离子脂质。
24.在其奶中产生修饰的胰岛素前体的非人转基因哺乳动物
25.权利要求24的非人转基因哺乳动物，其中哺乳动物属于牛物种、猪物种、绵羊物 种、公山羊物种或啮齿动物物种。
26.权利要求25的非人转基因哺乳动物，其中哺乳动物属于牛物种。
27.权利要求24的非人转基因哺乳动物，其中修饰的胰岛素前体是修饰的哺乳动物胰 岛素前体。
28.权利要求27的非人转基因哺乳动物，其中修饰的哺乳动物胰岛素前体是修饰的人 胰岛素前体、修饰的牛胰岛素前体、修饰的猪胰岛素前体、修饰的绵羊胰岛素前体、修饰的 公山羊胰岛素前体或修饰的啮齿动物胰岛素前体。
29.权利要求28的非人转基因哺乳动物，其中修饰的哺乳动物胰岛素前体是修饰的人 胰岛素前体。
30.权利要求24的非人转基因哺乳动物，其中修饰的胰岛素前体不会在非人转基因动 物中引起低血糖。
31.权利要求30的非人转基因哺乳动物，其中修饰的胰岛素前体包含修饰的C肽。
32.权利要求31的非人转基因哺乳动物，其中修饰的C肽包含通常未在天然存在的胰 岛素原中发现的氨基酸。
33.权利要求32的非人转基因哺乳动物，其中修饰的C肽包含以下三个氨基酸: Ala-Ala-Lyso
34.权利要求31的非人转基因哺乳动物，其中修饰的胰岛素前体进一步包含修饰的B链。
35.权利要求34的非人转基因哺乳动物，其中修饰的B链包含天然存在B链的几乎所 有C端。
36.权利要求24的非人转基因哺乳动物，其基因组包含整合的质粒，其中该质粒包含 编码修饰的人胰岛素前体的序列，该序列可操作地连接到指导该序列在哺乳动物的乳房细 胞中表达的启动子上。
37.权利要求36的非人转基因哺乳动物，其中哺乳动物属于牛物种、猪物种、绵羊物 种、公山羊物种或啮齿动物物种。
38.权利要求37的非人转基因哺乳动物，其中哺乳动物属于牛物种。
39.权利要求24的非人转基因哺乳动物，其中修饰的胰岛素前体是修饰的哺乳动物胰 岛素前体。
40.权利要求39的非人转基因哺乳动物，其中修饰的哺乳动物胰岛素前体是修饰的人 胰岛素前体、修饰的牛胰岛素前体、修饰的猪胰岛素前体、修饰的绵羊胰岛素前体、修饰的 公山羊胰岛素前体或修饰的啮齿动物胰岛素前体。
41.权利要求40的非人转基因哺乳动物，其中修饰的哺乳动物胰岛素前体是修饰的人 胰岛素前体。
42.权利要求41的非人转基因哺乳动物，其中启动子是0酪蛋白启动子。
43.权利要求42的非人转基因哺乳动物，其中质粒进一步包含抗生素抗性基因。
44.权利要求43的非人转基因哺乳动物，其中抗生素抗性基因是新霉素抗性基因。
45.权利要求44的非人转基因哺乳动物，其中质粒是p0 mhuIP。
46.在其奶中产生修饰的人胰岛素前体的牛物种的非人转基因哺乳动物，其基因组包 含整合的质粒，其中该质粒包含编码修饰的人胰岛素前体的序列和指导该序列在哺乳动物 的乳房细胞中表达的0酪蛋白启动子。
47.权利要求46的非人转基因哺乳动物，其中质粒进一步包含新霉素抗性基因。
48.权利要求47的非人转基因哺乳动物，其中质粒是p0 mhuIP。
49.权利要求48的非人转基因哺乳动物，其中在哺乳动物的体细胞和生殖细胞中都发现了整合的质粒。
50.权利要求46的非人转基因哺乳动物，其中修饰的人胰岛素前体不会在非人转基因 动物中引起低血糖。
51.权利要求50的非人转基因哺乳动物，其中修饰的人胰岛素前体包含修饰的C肽。
52.权利要求51的非人转基因哺乳动物，其中修饰的C肽包含通常未在天然存在的胰 岛素原中发现的氨基酸。
53.权利要求52的非人转基因哺乳动物，其中修饰的C肽包含以下三个氨基酸 Ala-Ala-Lyso
54.权利要求51的非人转基因哺乳动物，其中修饰的人胰岛素前体进一步包含修饰的 B链。
55.权利要求54的质粒，其中修饰的B链包含天然存在B链的几乎所有C-端。
56.制备非人转基因哺乳动物的方法，包括a)将编码修饰的胰岛素前体的核酸序列克隆至质粒中，由此将该序列可操作地连接到 将指导该序列在乳房细胞中表达的启动子上，得到表达质粒；b)用表达质粒转染体细胞，使得质粒整合至细胞的基因组中，得到转基因体细胞；c)将成熟的卵母细胞去核，得到去核的卵母细胞；d)将一个转基因体细胞与去核的卵母细胞融合，得到单细胞胚胎；e)将胚胎植入受体哺乳动物的子宫中；和f)监视妊娠直到转基因哺乳动物的出生。
57.权利要求56的方法，其中启动子是0酪蛋白启动子，并且其中修饰的胰岛素前体 是修饰的人胰岛素前体。
58.权利要求57的方法，其中表达质粒进一步包含新霉素抗性基因。
59.权利要求58的方法，其中表达质粒是p0 mhuIP。
60.权利要求56的方法，其中哺乳动物是在其奶中产生修饰的人胰岛素的牛，其基因 组包含整合的质粒，其中该质粒包含编码修饰的人胰岛素前体的序列和指导该序列在哺乳 动物的乳房细胞中表达的0酪蛋白启动子。
61.权利要求60的方法，其中质粒进一步包含新霉素抗性基因。
62.权利要求61的方法，其中质粒是p^mhuIP。
63.权利要求56的方法，其中体细胞是成纤维细胞。
64.权利要求56的方法，其中通过从用于在其奶中产生修饰的胰岛素前体的转基因雌 性动物分离来获得转基因体细胞。
65.权利要求64的方法，其中转基因体细胞是成纤维细胞。
66.权利要求56或64的方法，其中在哺乳动物的体细胞和生殖细胞中都发现了编码修 饰的胰岛素前体的序列，其可操作地连接到指导该基因在乳房细胞中表达的启动子上。
67.权利要求56或64的方法，其中哺乳动物属于牛物种、猪物种、绵羊物种、公山羊物 种或啮齿动物物种。
68.权利要求67的方法，其中哺乳动物属于牛物种。
69.权利要求56或64的方法，其中修饰的胰岛素前体是修饰的哺乳动物胰岛素前体。
70.权利要求69的方法，其中修饰的哺乳动物胰岛素前体是修饰的人胰岛素前体、修饰的牛胰岛素前体、修饰的猪胰岛素前体、修饰的绵羊胰岛素前体、修饰的公山羊胰岛素前 体或修饰的啮齿动物胰岛素前体。
71.权利要求70的方法，其中修饰的哺乳动物胰岛素前体是修饰的人胰岛素前体。
72.权利要求56或64的方法，其中修饰的胰岛素前体不会在非人转基因哺乳动物中引 起低血糖。
73.权利要求72的方法，其中修饰的人胰岛素前体包含修饰的C肽。
74.权利要求73的方法，其中修饰的C肽包含通常未在天然存在的胰岛素原中发现的氨基酸。
75.权利要求74的方法，其中修饰的C肽包含以下三个氨基酸Ala-Ala-LyS。
76.权利要求73的方法，其中修饰的人胰岛素前体进一步包含修饰的B链。
77.权利要求76的方法，其中修饰的B链包含天然存在B链的几乎所有C-端。
全文摘要
本发明涉及用于生产对哺乳动物可能有毒的目标蛋白的非人转基因动物。该哺乳动物的特征在于以下事实其是转基因的，用于在其奶中产生失活形式的目标蛋白，优选重组人胰岛素。不可能在转基因哺乳动物中产生重组人胰岛素，因为该分子在哺乳动物中具有一定程度的生物活性，并可能对哺乳动物是有毒的。因此，本发明涉及克隆遗传构建体，该遗传构建体包含编码修饰的人胰岛素前体的序列，该序列处于表达载体中的β酪蛋白启动子的控制下。本发明还包括将该表达质粒转染至胎牛体细胞，如成纤维细胞中，并通过核移植将牛卵母细胞去核来产生转基因胚胎。本发明产生了能够在其乳腺中产生修饰的人胰岛素前体的转基因牛。此后，可以收集这些转基因哺乳动物的奶，可以在体外将修饰的人胰岛素前体转化成重组的人胰岛素，并将重组的人胰岛素纯化至作为纯生物药品的同质性。
文档编号C12N15/00GK101802210SQ200880022998
公开日2010年8月11日 申请日期2008年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者A·伯克维奇, A·普林克, C·梅洛, M·克里斯库罗, N·费尔南德斯 申请人:斯特林贝尔德生物技术北美公司