一种启动子及表达外源蛋白的重组表达系统的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种新的启动子序列，可以应用于柄篮状菌表达系统，实现柄篮状菌对外源蛋白的表达。本发明还构建了一种新型表达载体，可用于以柄篮状菌为宿主细胞的转化方法；本发明还提供了一种表达外源蛋白的新方法，能高效表达黑曲霉（Aspergillus?niger）的植酸酶、特异腐质霉（Humicola?insolens）的纤维素内切酶、烟曲霉（Aspergillus?fumigatus）的脂肪酶、里氏木霉（Trichoderma?reesei）的木聚糖酶、枯草芽孢杆菌（Bacillus?subtilis）的果胶酶等多种外源基因，摇瓶发酵蛋白表达量约为0.3-1.0g/L，酶活约为30-90IU/ml。本发明提供的表达载体和表达外源蛋白的新方法将有利于实现更多蛋白质的工业化生产，从而降低生产成本。
【专利说明】一种启动子及表达外源蛋白的重组表达系统
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学和遗传工程【技术领域】，具体涉及一种启动子及表达外源蛋白的重组表达系统。
【背景技术】
[0002]通过基因重组技术生产有价值的外源性蛋白质是当今生物技术研究与开发的热点之一。细菌、酵母和丝状真菌具有生长快、易培养、表达量高以及分子操作简单的特点，这使得它们已广泛地开发应用于异源蛋白质的表达(张小霞等，2004，国外医学卫生学分册)。目前已有的比较成熟的细菌类表达系统有大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌、假单胞菌和克雷伯氏菌等；而真菌类表达系统有酵母类和丝状真菌类，其中酵母类有酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、多型汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母和乳酸克鲁维酵母；而丝状真菌类有镰刀菌、木霉、黑曲霉、粗糙脉孢霉和米曲霉等。但由于受蛋白自身结构、分子大小和翻译后修饰等影响，不同表达系统中目的蛋白的表达量(活性)往往不一样，这就需要选择合适的表达系统。选择合适的表达系统往往要考虑以下因素:表达量、目的用途、筛选策略、密码偏爱性、蛋白可溶性、纯化回收、宿主的蛋白酶和修饰系统等。尤其是目的蛋白的用途是重要的考虑因素，如药物筛选要求保持蛋白天然状态，抗原蛋白仅需考虑表达量，饲用或食用蛋白需要考虑表达系统的安全性，而工业应用类则需多考虑蛋白的功能。因此，尽管很多研究机构和生物企业开发了很多表达系统；但是，每个表达系统总有其优点和缺点，任何一个表达系统不可能适合表达所有的蛋白。
[0003]下面介绍目前使用的几种表达系统:
[0004]I)大肠杆菌表达系统开发至今已超过30年、也是应用最广泛的蛋白表达系统；其优点是遗传背景清楚、繁殖快、表达量高(l_5g/l);但是缺点也很明显，对结构复杂如二硫键的蛋白极易形成无活性的包`涵体，加之胞内表达需要破碎细胞、使得下游处理工艺复杂(Jana, S., and Deb, J.Κ.2005, App1.Microbiol.Biotechnol.)。
[0005]2)德国MoBiTec公司开发了 B.megaterium和B.subtilis为宿主的表达系统。芽孢杆菌宿主的优点是:公认的安全菌株、分泌表达、无明显的密码偏爱性。其缺点是:分泌大量能降解目的蛋白的胞外蛋白酶。因此，敲除芽孢杆菌的蛋白酶基因是其高效表达的关键步骤之一。
[0006]3)链霉菌是革兰氏阳性原核细菌，它具有发酵成本低，分泌水平高的特点。但是，链霉菌往往不能高水平的表达真核生物的基因。目前，报道最多的是变铅青链霉素(Steptomyces lividans)。加拿大Cangene公司利用该菌生产的巨卩遼细胞集落刺激因子已到 III期临床水平。
[0007]4)酵母表达系统的优点是代时短、生长快，分泌表达和翻译后修饰系统；所以其表达蛋白多能正确折叠而具活性。由酵母成功表达的蛋白有3000多种，包括以用于临床的胰岛素和乙肝疫苗等。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)应用历史最悠久,广泛应用于酿酒和烘焙；也是第一个用于异源表达的酵母(Strausberg and Strausberg, 2001, Curr.Protoc.Protein Sci)0 S.verevisiae缺点是质粒不稳定、拷贝数低和表达蛋白的高度糖基化。目前，已开发的酵母类表达系统有很多；其中毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统应用最广最成功、蛋白表达量达77mg-20g/l不等；其表达的分子量最大蛋白是β -半乳糖苷酶(117kDa) (Cregg, J.Μ., 2007, Methods Mol.Biol.)。
[0008]5)丝状真菌具有很高的蛋白质分泌能力，能进行各种翻译后加工，如内含子剪切和糖基化修饰等。丝状真菌如曲霉(Aspergillus)等又是公认安全菌株(GRAS);因此丝状真菌表达生产外源蛋白已经广泛用于工业酶的生产(唐国敏，1992，真菌学报；吴其威，1993，生命科学)。已成功工业化开发的丝状真菌表达系统有里氏木霉表达系统，黑曲霉表达系统和米曲霉表达系统等。
[0009]尽管上述表达系统已广泛应用于工业生产中，但仍然不能满足工业上对于成本降低的需要，此外，还有很多蛋白因为没有合适的表达系统，无法实现放大生产和应用，因此开发新型的表达系统，寻找更多、更高效的表达外源蛋白的方法，一直是本领域技术人员的研究热点和难点。
【发明内容】
[0010]本发明为解决现有技术问题，提供了一种新型启动子及由该启动子所构建的表达外源蛋白的表达系统。 申请人:从柄篮状菌(Talaromyces stipitatus)中分离得到了 cbhl(纤维素外切酶I)启动子和终止子序列，构建得到一种新型表达载体，并开发出一种以柄篮状菌为宿主细胞、以硫胺素作为筛选标记的高效表达外源蛋白的方法，从而丰富现有的蛋白质表达系统。
[0011]本发明一方面提供了一种启动子，其特征在于，所述启动子包含有:
[0012]a)核苷酸序列为SEQ ID NO:1的启动子；
[0013]b)与a)中的启动`子序列相似性不低于90%,且具有a)中启动子功能的启动子。
[0014]上述b)中序列相似度优选为95%，更优为98%.[0015]本发明另一方面提供了一种含有上述启动子的表达载体。
[0016]所述表达载体优选携带有柄篮状菌cbhl基因的终止子。
[0017]所述终止子，其一种核苷酸序列为SEQ ID N0:2。
[0018]在表达载体上还包含有筛选标记，
[0019]所述的筛选标记可以是表达载体中常用的。
[0020]本发明还提供一种表达系统，其中宿主为柄篮状菌，表达载体为携带有上述启动子的真核表达载体；
[0021]上述的表达系统中，筛选标记优选为硫胺素抗性基因(Pyrithiamine ResistanceGene,ptrA)。
[0022]所述的柄篮状菌宿主优选柄篮状菌VL-1 (Talaromyces stipitatus VL-1),已于2013年12月20日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCN0:M2013679o
[0023]本发明还提供了一种表达外源蛋白的方法，包括如下步骤:
[0024]I)外源基因的克隆；
[0025]2)利用上述表达载体，构建携带步骤I)外源基因的重组表达载体；[0026]3)将重组表达载体转化柄篮状菌，获得重组表达外源蛋白的重组菌株。
[0027]其中步骤3)所述转化方法可选用电击转化法、农杆菌介导转化法或原生质体转化法中的任意一种。
[0028]步骤3)所述转化方法优选原生质体转化法。
[0029]所述原生质体转化法包括柄篮状菌原生质体的制备、转化和筛选步骤，
[0030]所述柄篮状菌原生质体的制备方法，包括:将柄篮状菌接种至YEG培养基，培养温度为26-32°C，优选28°C ;转速为200_250rpm，优选200rpm ;培养时间为20-36小时，优选24小时；加入去细胞壁的酶，可选自溶壁酶，蜗牛酶和/或纤维素酶，优选裂解酶，其工作浓度为5-20mg/ml，优选10mg/ml，作用2-4小时。
[0031]所述转化方法选用的融合试剂为聚乙二醇(PEG)，优选PEG4000。
[0032]所述筛选方法中选用的筛选标记优选硫胺素抗性基因(PyrithiamineResistance Gene, ptrA),其工作浓度为 0.4-1.4 μ g/ml。
[0033]本发明提供了一种新的启动子序列，可以应用于柄篮状菌表达系统，实现柄篮状菌对外源蛋白的表达。本发明还构建了一种新型表达载体，可用于以柄篮状菌为宿主细胞的转化方法；本发明还提供了一种表达外源蛋白的新方法，能高效表达黑曲霉(Aspergillus niger)的植酸酶、特异腐质霉(Humicola insolens)的纤维素内切酶、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的脂肪酶、里氏木霉(Trichoderma reesei)的木聚糖酶、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的果胶酶等多种外源基因，摇瓶发酵蛋白表达量约为0.3-1.0g/L，酶活约为30-90IU/ml。本发明提供的表达载体和表达外源蛋白的新方法将有利于实现更多蛋白质的工业化生产，从而降低生产成本。`【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1:柄篮状菌野生型和突变体菌落形态比较。
[0035]图2:表达质粒pTS-phyA的质粒图谱，
[0036]其中，Pcbhl为启动子序列(SEQ ID NO: l)，phyA指被表达的植酸酶基因，Tcbhl为终止子序列(SEQ ID NO:2)，Amp为氨苄青霉素抗性标记，ColE ori为质粒复制起始位点。
[0037]图3:阳性转化子TS-1的摇瓶发酵上清液SDS-PAGE电泳图，其中，泳道I为蛋白maker ;泳道2为宿主阴性对照；泳道3为阳性转化子TS-1发酵上清液，箭头所指处蛋白条带即为重组表达的外源植酸酶。
[0038]图4:阳性转化子发酵上清液SDS-PAGE电泳图，其中泳道1，2，3分别为获得的三个阳性转化子发酵上清液，箭头所指处蛋白条带即为重组表达的外源纤维素内切酶。
【具体实施方式】
[0039]本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook,2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(AusubeI, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。而不仅限于实施例所记载的具体方法、实验方案和试剂，本领域的技术人员可在本发明技术方案的基础上选择其它常规方法。
[0040]除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY, 3nd Ed.(Singleton et al.，2006)和 COLLINS DICTIONARY BIOLOGY(Hale etal.，2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。
[0041]除非另作说明，核酸是按5,至3,方向从左至右书写；氨基酸是按氨基至羧基的方向从左至右书写。
[0042]如本文所用，术语“重组”当被用于修饰细胞、核酸、蛋白或载体时，表示该细胞、核酸、蛋白或载体已通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白而被修饰。因此，例如，重组细胞是表达在天然(非重组)形式的该细胞中不曾发现的基因，或者表达天然基因。
[0043]术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可以互换使用。本文使用氨基酸残基的传统的单字母或三字母代码。
[0044]如本文所用，术语“基因”指参与生产多肽的DNA片段，包括编码区之前和之后的区域，以及各编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
[0045]术语“核酸”包括DNA、RNA,单链或双链的，以及它们的化学修饰的衍生物。
[0046]术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用。
[0047]术语“载体”指被设计用来将核酸导入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌粒、序列盒以及类似物。
[0048]术语“表达载体”表示包含目的DNA序列的DNA构建物，所述DNA序列被可操纵的连接于能够影响该DNA在合适宿主中表达的合适的控制序列。此类控制序列可以包括完成转录的启动子、可选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻 译的终止的序列。
[0049]术语“启动子”表示参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。
[0050]术语“终止子”表示DNA分子中终止转录的核苷酸序列。
[0051]与另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比较这两个序列时所述百分比的碱基或氨基酸残基是相同的。
[0052]由于遗传密码是简并的，所以可以使用一种以上的密码子来编码特定的氨基酸，本发明包括编码特定的氨基酸序列的多核苷酸。
[0053]术语“筛选标记”表示抗生素抗性标记基因，如红霉素、氯霉素等抗性标记基因。依据原理是负筛选，即未转化细胞被抗生素杀死，而转化细胞因携带抗生素抗性基因而存活，从而将含有外源基因的转化细胞和不含外源基因的非转化细胞分开。
[0054]术语“宿主菌株”或“宿主细胞”是指表达载体或DNA构建物的合适宿主，所述表达载体或DNA构建物包含本发明的编码脂肪酶的多核苷酸。具体而言，宿主菌株优选地是丝状真菌细胞。该宿主细胞可以是野生型丝状真菌宿主细胞或者经遗传修饰的宿主细胞。术语“宿主菌株”或“宿主细胞”指由丝状真菌菌株细胞所产生的细胞核原生质体。
[0055]如本文所用，术语“柄篮状菌”，拉丁文名“Talaromyces stipitatus”,本发明所述柄篮状菌还涉及柄篮状菌的亚种，以及以该菌株为野生型获得的突变型。
[0056]下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。
[0057]实施例1柄篮状菌(Talaromyces stipitatus)的活化[0058]本发明选用的柄篮状菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号CGMCC3.4299。
[0059]配制PDA固体平板:称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖和15g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，115°C灭菌30分钟后，备用；
[0060]菌种活化:将上述柄篮状菌接种至PDA固体平板上进行菌种活化，培养温度为28℃。
[0061]实施例2表达质粒的构建
[0062]2.1柄篮状菌基因组DNA的提取
[0063]从PDA固体平板上刮取上述柄篮状菌菌丝，放入2ml的印pendorf管中，加入500 μ 1 的 2XCTAB 缓冲液(100mmol/L Tris-HCl (pH8.0), 20mmol/LEDTA, 1.4mol/L NaCl,2%(w/v)CTAB，40mmol/L巯基乙醇)和 500 μ 1 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)溶液，37°C，220rpm振荡1-1.5h，然后离心13200rpmX15min ;取上清液并加入等体积的异丙醇，-20°C沉淀0.5-2小时，然后离心12000rpmX IOmin ;最后，用75%乙醇洗涤沉淀I次、待沉淀干燥后加入30-50 μ 1含有RNase的去离子水；提取的DNA作为PCR反应模板。
[0064]2.2cbhl启动子序列的克隆
[0065]以实施例2.1中提取的柄篮状菌基因组DNA为模板，利用引物proF和proR进行PCR扩增。
[0066]proF:CTGAAGCAAAGCAACAGCTC
[0067]proR:ACATGCATTGTGTCGTTTGCTTCTATTC ；
[0068]其中ATGCAT为Sph I酶切位点。
[0069]PCR 扩增条件是:95 °C 4min ；94 °C 40S ；55 °C 30S，72 °C 1.5min30 个循环；72°C7min。扩增产物凝胶回收后，克隆至pMD18_T simple载体(购自TaKaRa)，获得质粒pTPcbh，将质粒进行测序分析，结果显示克隆得到的cbhl基因的启动子序列为SEQ IDNO:1。
[0070]NCBI Blast序列比对结果显示，本发明克隆得到的cbhl基因的启动子序列SEQID NO:1与现有序列的相似性最高仅为47.7%，该启动子并没有在现有技术文献中报道过，为一新型的启动子。
[0071]2.3cbhl终止子序列的克隆
[0072]以实施例2.1中提取柄篮状菌的基因组DNA为模板，利用引物terF和terR进行PCR扩增。
[0073]
【权利要求】
1.一种启动子，其特征在于，所述启动子包含有: a)核苷酸序列为SEQID NO:1的启动子； b)与a)中的启动子序列相似性不低于90%，且具有a)中启动子功能的启动子。
2.一种表达载体，包括有启动子和终止子，其特征在于所述的启动子为权利要求1所述的启动子。
3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于所述的终止子的核苷酸序列为SEQIDNO:2。
4.如权利要求2或3所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体上还包含有筛选标记。
5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述的筛选标记为硫胺素抗性基因PtrA0
6.一种外源蛋白表达系统，包含有宿主和表达载体，其特征在于，所述的宿主为柄篮状菌，表达载体为权利要求2所述的表达载体。
7.如权利要求6所述的外源蛋白表达系统，其特征在于，所述的外源蛋白表达系统的筛选标记为硫胺素抗性基因。
8.如权利要求6所述的外源蛋白表达系统，其特征在于，所述的柄篮状菌为柄篮状菌VL-1，保藏编号为 CCTCC N0:M2013679o
9.一种表达外源蛋白的方法，包括如下步骤: 1)外源基因的克隆； 2)利用权利要求2所述的表达载体，构建携带步骤I)外源基因的重组表达载体； 3)将重组表达载体转化柄篮状菌，获得重组表达外源蛋白的重组菌株。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述的步骤3)中的转化柄篮状菌，所述的转化为电击转化法、农杆菌介导转化法或原生质体转化法中的任意一种。
【文档编号】C12R1/645GK103757019SQ201310717119
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】王华明, 黄亦钧, 赵倩, 许韡, 张慧丹, 刘士成 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司