在扩展青霉细胞内表达外源蛋白的表达设备及基因工程菌的制作方法

在扩展青霉细胞内表达外源蛋白的表达设备及基因工程菌的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种在扩展青霉细胞内表达外源蛋白的表达设备及基因工程菌；该表达设备从5’至3’依次包括以下元件：(a)扩展青霉的脂肪酶基因启动子；(b)多克隆位点；(c)构巢曲霉色氨酸合成酶C基因的终止子。将外源基因插入上述表达设备中，经T-DNA二元载体转化根癌农杆菌，和扩展青霉结合，所得扩展青霉基因工程菌可以高效表达来源于动物、植物和微生物等的异源基因，从中获得外源蛋白的大量生产。该扩展青霉生长旺盛，培养条件粗放、廉价，固体培养和液体深层发酵均可，适合用于生产工业需求量大的蛋白质。
【专利说明】在扩展青霉细胞内表达外源蛋白的表达设备及基因工程菌
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，特别涉及一种在扩展青霉细胞内表达外源蛋白的表达设备及基因工程菌。
【背景技术】
[0002]在蛋白质重组表达方面，丝状真菌表达系统具有优越于原核表达系统和酵母表达系统的独特优势。以大肠杆菌为代表的原核表达系统，缺少翻译后加工和折叠的机制；因此，在高效表达外源蛋白时容易产生包涵体，而包涵体复性是一个极其复杂和困难的过程。以酿酒酵母为代表的酵母表达系统在表达外源蛋白时虽然可以正确翻译和折叠，但是容易产生过度糖基化，因此表达高等真核生物基因时，产生有活性的蛋白比较困难。丝状真菌具有更高级的翻译、折叠和修饰系统，完全可以弥补上述不足。
[0003]扩展青霉是一种从土壤中分离到丝状真菌，该丝状真菌具有强大的脂肪酶生产能力，经过诱变和选育，其产脂肪酶的水平已经达到工业生产的要求(李强.扩展青霉FS1884脂肪酶基因在毕赤酵母GSl 15中的表达和定向进化研究.福建师范大学硕士学位论文.2009，pp8.);这表明扩展青霉的脂肪酶基因的启动子活力很强，细胞内蛋白的翻译、折叠和修饰系统很发达。此外，扩展青霉极易培养，在PH3-10之间均能很好的生长，发酵培养基只需要豆饼粉，淀粉和少量无机微量元素即可，发酵工艺成熟，具有良好的工业基础。因此，扩展青霉非常适合被开发为重组蛋白的表达系统，用于表达来源于动物、植物和微生物等的异源基因。

【发明内容】

[0004]本发明要解决的技术问题就是针对外源蛋白表达量低，提供一种操作简便快捷的用于在扩展青霉(Penicill`ium expansum)细胞内表达外源蛋白的表达设备及其基因工程菌。含有该表达设备的扩展青霉基因工程菌，可以高效表达来源于动物、植物和微生物等的异源基因
[0005]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
[0006]第一方面，本发明涉及一种在扩展青霉细胞内表达外源蛋白的表达设备，所述的表达设备从5’至3’依次包括以下元件:(I)控制外源基因在扩展青霉中转录的扩展青霉脂肪酶基因启动子(Plip) ;(2)多克隆位点；(3)控制外源基因在扩展青霉中终止转录的构巢曲霉色氨酸合成酶终止子(Ttape)。
[0007]本发明中，所述的启动子是能够控制异源基因在扩展青霉中转录的启动子，较佳的为扩展青霉脂肪酶基因启动子(Plip)，更佳的启动子序列是序列表中的SEQ ID N0:7所示的序列。
[0008]本发明中所述的多克隆位点可以是本领域各种常规的多克隆位点，较佳的多克隆位点序列是序列表中SEQ ID NO:8所示。
[0009]本发明中所述的终止子是能够控制异源基因在扩展青霉中终止转录的终止子，较佳的是构巢曲霉色氨酸合成酶C的终止子(Ttap。)，更佳的终止子序列是序列表中SEQ IDNO:9所示。
[0010]较佳的所述的表达设备还包括以下元件:(4)筛选标记基因的表达盒。其位于表达元件(I)启动子的上游或者元件(3)终止子的下游。
[0011]本发明中所述的筛选标记基因的表达盒能够在扩展青霉中表达本领域的常规筛选标记，较佳的筛选标记是新霉素磷酸转移酶或潮霉素磷酸转移酶、更佳的筛选标记是潮霉素磷酸转移酶，其更佳的基因序是列序列表中SEQ ID N0:10所示。
[0012]较佳的，所述的在扩展青霉细胞内表达外源蛋白的表达设备还进一步包括外源蛋白的编码序列，其位于第(2)元件多克隆位点之中、之前或之后。所述的外源蛋白基因来源于植物、动物、微生物以及人工合成等。
[0013]第二方面，本发明涉及一种含有上述任何一种表达设备的载体。较佳的是根癌农杆菌二院载体，如 T-DNA 表达载体 pPZP100、pPZP201、pPZP201B、pPZP201BK、pBI121、pCAMBIA或pPK2，但不限于这些载体，更佳的选自pCAMBIA
[0014]第三方面，本发明涉及一种含有上述任何一种载体的转化子(宿主细胞)。较佳的是根癌农杆菌 LBS4404、 GV2260、C58C1、GV3100、A136、GV3101、AGL-1、EHA101、EHA105，更佳的是根癌农杆菌EHA105。
[0015]第四方面，本发明涉及一种表达外源蛋白的扩展青霉基因工程菌，所述基因工程菌的基因组中含有包括外源蛋白的编码序列的表达设备。
[0016]第五方面，本发明涉及一种表达外源蛋白的扩展青霉基因工程菌的制备方法，包括将上述含有筛选标记基因的表达盒的表达设备的根癌农杆菌二元载体转化根癌农杆菌，将所得的根癌农杆菌转化子和扩展青霉共培养，挑选基因组中整合有外源基因的表达设备的转化子，即为表达外源蛋白的扩展青霉基因工程菌。该扩展青霉基因工程菌可高效表达来源于动物、植物和微生物等的异源基因。
[0017]第六方面，本发明涉及一种生产蛋白的方法，包括培养所述的表达外源蛋白的扩展青霉基因工程菌，从培养体系中获得该外源蛋白。
[0018]第七方面，本发明还涉及一种上述表达外源蛋白的扩展青霉基因工程菌在制备工业酶制剂、饲料添加剂或蛋白质药物中的用途。所述酶制剂为脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、丹宁酸酶。
[0019]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
[0020]1、本发明的扩展青霉表达设备在以环化质粒上，易于保存和DNA操作。
[0021]2、本发明的扩展青霉表达设备利用农杆菌结合转移技术，可以提高转化效率，缩短操作时间和工作量。
[0022]3、本发明的扩展青霉表达设备含有扩展青霉来源的启动子(Plip)，该启动子与菌株共同进化了很多年，启动子和菌株的匹配度高，活性强；能够驱动绝大多数异源基因的高效表达。
[0023]4、本发明的扩展青霉表达设备的多克隆位点含有稀有接口，兼容绝大多数异源基因的连接，节约操作时间提高工作效率。
[0024]5、本发明的基因工程菌可以作为当前扩展青霉脂肪酶(PEL)生产菌(即是诱变选育的用于生产脂肪酶的扩展青霉菌)的诱导剂和抑制剂筛选的灵敏指示剂。[0025]6、本发明中鉴定出的诱导剂和抑制，可以用来精细调控所述表达设备，当需要提高异源基因表达量时加入诱导剂；当需要减少表达产物时，适当加入抑制剂
[0026]7、本发明提供的表达设备，可以实现来源于动物、植物和微生物的异源基因在扩展青霉中的高效表达。由于扩展青霉培养条件粗放，适合用于固体培养和液体深层发酵，成本低廉；因此本发明可以为洗涤、制革、纺织、造纸等酶制剂行业提供基因工程菌生产菌株，提高酶制剂的生产效率降低生产成本。
【专利附图】

【附图说明】
[0027]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
[0028]图1为扩展青霉表达设备的物理图谱；其中，Plip:扩展青霉脂肪酶基因启动子；MSC:多克隆位点；Ttap。:构巢曲霉色氨酸合成酶C终止子；Hyg Box:潮霉素磷酸转移酶基因筛选标记盒；Sal I，Pme 1:为相应的限制性酶切位点；
[0029]图2为扩展青霉表达载体pCHAMBIA2300: =Plip-Ttrpc的构建图；
[0030]图3为含有β-葡萄糖苷酸酶基因⑶S的重组表达载体pCHAMBIA2300::Plip-GUS-Ttrpc 的构建图；
[0031]图4为⑶S基因在扩展青霉中的表达；其中，I，诱导培养的原始扩展青霉经⑶S染色后的结果；11、II1、IV:诱导培养的扩展青霉基因工程菌经GUS染色后的结果；
[0032]图5为不同化学物质对扩展青霉基因工程菌表达GUS的影响；其中，Α，葡萄糖对⑶S表达的影响，1、I1、II1:培养基中未添加葡萄糖的染色结果，IV、V、V1:培养基中添加了葡萄糖的染色结果；Β，橄榄油对GUS表达的影响。a、b、c:培养基中添加了橄榄油的染色结果，d、e、f:培养基中未添加橄榄油的染色结果。
【具体实施方式】
[0033]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0034]本发明涉及在扩展青霉细胞内表达外源蛋白的表达设备及基因工程菌。所述表达设备通过农杆菌结合转移到扩展青霉细胞，培养筛选转化子制备得到基因工程菌。通过培养扩展青霉基因工程菌，外源蛋白得以高效表达。
[0035]一、扩展青霉表达设备的构建
[0036]本发明提供了一种在扩展青霉细胞内表达外源蛋白的表达设备。所述表达设备通过农杆菌结合转移到扩展青霉细胞。通过培养扩展青霉基因工程菌，外源蛋白得以高效表达。
[0037]本发明的扩展青霉表达设备的物理图谱如图1所示，其制备方法如下:
[0038](I)通过限制性酶切技术，获得潮霉素磷酸转移酶基因表达盒，作为筛选标记。
[0039](2)通过PCR扩增，分别得到扩展青霉脂肪酶基因启动子(Plip)和构巢曲霉色氨酸合成酶C终止子(Ttrpc)。[0040](3)将潮霉素B筛选标记盒、启动子(Plip)、多克隆位点、终止子(Ttape)连接到表达载体中，构建得到重组表达载体1，即为PCHAMBIA2300: =Plip-Ttrpc ;对应的构建图如图2所示。这里的表达载体主要起大量拷贝本表设备和提供农杆菌结合转移位点的作用，所以可以选择任何一种农杆菌二元载体，如 ρΡΖΡΙΟΟ、pPZP201、pPZP201B、pPZP201BK、pBI121、pCAMBIA或pPK2，但不限于这些载体。
[0041](4)将异源基因插入到上述表达载体I中，即外源基因位于Plip和Itepc之间，得到重组表达质粒2，即是pCHAMBIA2300::Plip-GUS-TtapC。对应的构建图如图3所示。
[0042]上述步骤(3)中，将筛选标记、启动子、多克隆位点和终止子连接到目标载体上，可以用限制性内切酶酶切和连接酶连接的方法将各个元件连入表达载体，所述的限制性内切酶酶切和连接酶连接都是本领域常规做法。
[0043]上述步骤(4)中，将异源基因插入到上述表达载体I中，可以用限制性内切酶酶切和连接酶连接的方法将目标基因连入表达载体I中，所述的限制性内切酶酶切和连接酶连接都是本领域常规做法。
[0044]二、扩展青霉基因工程菌
[0045]本发明提供了一种扩展青霉基因工程菌，该基因工程菌是将本发明的表达设备通过农杆菌结合转移入扩展青霉细胞，培养筛选转化子制备而得，具体制备步骤如下:
[0046](I)将本发明的含有表达设备的载体转化根癌农杆菌；再利用结合转移机制转化
扩展青霉。
[0047](2)将上述转化的细胞进行筛选、鉴定，得到表达外源蛋白的重组扩展青霉菌种。
[0048]下面用实施例来进一步说明本发明，但是本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造商所建议的条件。下列实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0049]扩展青霉菌株从中国药用微生物菌种保藏管理中心购买(Center for culturecollection of pharmaceutical microorganisms, CPCC),保藏编号为 CPCC460013。购买后，接种在PDA斜面培养基上，在26°C条件下培养20天，然后保存于4°C冰箱。
[0050]大肠杆菌DH5a菌株已在《刘静华，包英华，陈燕飞；大肠杆菌DH5 a感受态细胞转化率的改进，韶关学院学报，2008，29 (03):87-90》文献中公开。大肠杆菌DH5 a菌株的感受态细胞可通过供应商天根生化科技(北京)有限公司购买，货号CB101-03。
[0051]根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28 (3):38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心 BiovectorScience Lab 购得，货号为 Biovector-375。
[0052]在本发明的下述实施例中所用到的培养基和溶液配方如下:
[0053]CTAB 提取液:2% CTAB ；2% PVP ；IOOmM Tris-HCl ρΗ8.0 ；20mM EDTA ；1.4M NaCl ；使用时加入2% (v / v)的巯基乙醇。 [0054]PDA培养基(g / L):马铃薯，200 ;蔗糖，20 ;琼脂，15 ；pH自然。
[0055]MM 培养基:1M K2HPO4-KH2PO4 (pH7.0) IOmL, M-N(MgSO4.7H2030g / L, NaCl 15g /L) 20mL, I % CaCl2.2H201mL, 20 % 葡萄糖 10mL,0.01 % FeSO4IOmL, Spore element(ZnSO4.7H20100mg / L, CuSO4.5H20100mg / L, H3BO3IOOmg / L, MnSO4.H2OlOOmg / L,Na2MoO4.2H20100mg / L))5mL,20% NH4N032.5mL，无菌水 941.5mL。
[0056]IM 培养基:IM K2HPO4-KH2PO4 (pH7.0) IOmL, M-N (MgSO4.7H2030g / L,NaCl 15g / L) 20mL, I % CaCl2.2H201mL, 20 % 葡萄糖 10mL，0.01 % FeSO4IOmL, Sporeelement (ZnSO4 *7H20100mg / LjCuSO4 *5H20100mg / L, H3BO3IOOmg / LjMnSO4.H2OIOOmg /L, Na2MoO4.2H20100mg / L) 5mL, 20 % NH4N032.5mL, 50 % 甘油 I OmL, IM MES (pH5.5)40mL,IOOmM AS(乙酰丁香酮)2mL，无菌水 898.7mL。
[0057]CM培养基:加一半頂培养基的葡萄糖量，外加1.5%琼脂，其它成份同頂培养基。
[0058]GM 培养基(% ):黄豆饼粉 4，玉米淀粉 0.8，NaNO30.3，Na2HPO40.2，K2SO40.25，MgSO40.03，FeSO40.003。
[0059]GUS 染液配方:100mM Na3P04pH7.0,2mM X_Gluc，0.5 % Triton X_100，2mMK3 [Fe (CN) 6]，2mM K4 [Fe (CN) 6]
[0060]察氏培养基配方(g/ L):NaN0s3 ；K2HPO41 ；MgS040.5 ；KC10.5 ；FeS040.01 ;蔗糖 30。
[0061]实施例1、扩展青霉异源表达设备的制备
[0062](I)利用限制性内切酶Sac 1，Sal I将潮霉素抗性表达盒从质粒pV2 (Wang Y，Guo B, Miao Z, Tang K.Transformation of taxol-producing endophytic fungi byrestriction enzyme-mediated integration (REMI).FEMS Microbiology letter,2007,253-259)上酶切出来，片段经凝胶回收，克隆到pCAMBIA2300质粒的相应酶切位点上，获得具有潮霉素抗性的重组质粒PCHAMBIA2300 ;潮霉素表达盒也可来自其它含该序列的任何DNA，其中潮霉素磷酸转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
[0063](2)取扩展青霉菌 丝体0.2g经液氮研磨，加入ImL CTAB提取液，65°C水浴30min，12000rpm / min 离心 IOmin,取上清液；A 0.7mL 的 KAC (2.5M, pH4.8)，12000rpm / min 离心IOmin离心，取上清液；然后往上清液中加入0.6mL的异丙醇，沉淀DNA ;基因组DNA经75%的乙醇洗涤两次，溶解于双蒸水中备用。
[0064](3)根据扩展青霉脂肪酶基因5’端侧翼序列(GenBank Accession:DQ677520),设计:
[0065]正向引物Pl，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中含有限制性酶Sal I切点；
[0066]反向引物P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其中含有限制性酶Spe I切点；
[0067]以扩展青霉基因组DNA为模板，利用PCR技术扩增全基因序列。PCR反应条件为:950C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 120s，35 个循环；72°C IOmin ;然后将目标片段回收，获得了包含启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0068](4)根据质粒 pPAN7_l (GenBank Accession:Z32698)的序列设计:
[0069]正向引物P3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，该引物包含多克隆位点序列如SEQ ID NO:8所示，其中含有限制性酶Spe I和Swa I切点；
[0070]反向引物P4，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，其中含有限制性酶Pme I切点；
[0071]利用PCR技术扩增出色氨酸合成酶C终止子Itepc，其核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。PCR 反应条件为:95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 60s，35 个循环；72°C IOmin0
[0072](5)取(3)和(4)的反应液各IyL作为模板，以Pl作为正向引物；以P4作为反向引物，进行 PCR 扩增，PCR 的反应条件为:95°C 5min ；95°C 30s, 56 °C 30s, 72 °C 180s，35个循环；72°C IOmin0反应结束后，将PCR扩增产物进行凝胶柱回收，并用限制性内切酶Sal I和Pme I进行酶切，然后克隆至pCHAMBIA2300相应位点，获得重组表达载体1，即为PCHAMBIA2300::Plip_TtrpC。
[0073](6)根据 GUS 基因(GenBank Accession:S69414)的序列设计:
[0074]正向引物P5，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，其中含有限制性酶Spe I切点；
[0075]反向引物P6，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，其中含有限制性酶Swa I切点；
[0076]利用PCR技术扩增全基因序列。PCR反应条件为:95°C 5min ；95°C 30s，56°C 30s，72°C 120s，35个循环；72°C IOmin0反应结束后，将PCR扩增产物进行凝胶柱回收，并用限制性内切酶Spe I和Swa I进行酶切，然后克隆至pCHAMBIA2300: =Plip-Ttrpc相应位点获得最终载体 pCHAMB IA2300::Plip-⑶S-Ttrpc。
[0077](7)对含有最终载体pCHAMBIA2300: =Plip-GUS-Ttrpc的菌进行扩大培养，并抽提质粒，利用冻融法转化工程农杆菌EHA105。以P5作为正向引物；以P6作为反向引物，对所挑选的株菌进行PCR鉴定，鉴定为阳性的菌株即为正确的重组农杆菌EHA105-pCHAMBIA2300::Plip-GUS-1tep。，可进一步进行后续的实验。
[0078]实施例2、扩展青霉基因工程菌的获得
[0079]详细步骤如下:
[0080](I)挑取分离纯化后的野生型扩展青霉接种于PDA平板上，于28°C培养20天左右，用无菌水洗 下成熟孢子。
[0081](2)将实例I中含终载体pCHAMBIA2300: =Plip-GUS-Ttrpc的工程农杆菌EHA105接种于含有100 μ g / mL链霉素、100 μ g / mL卡那霉素的LB液体培养基中28°C，200rpm过夜培养，用含有100 μ g / mL链霉素和100 μ g / mL卡那霉素的MM培养基重新活化，28°C，220rpm培养48小时。吸取适量的培养物5000rpm离心去上清，并用頂液体培养基洗涤，最后用頂液体培养基稀释至OD6tltl=0.15，然后在28°C，220rpm的条件下培养6~8小时，至OD600=0.5 ~0.6。
[0082](3)将第(I)步得到的新鲜孢子配制成1父107个/ mL浓度的悬浮液，随后取上述孢子悬液与步骤(2)中的工程农杆菌等体积混合，取200 μ L均匀涂布到铺有玻璃纸的CM培养基(含ASZOOyg / mL)之上，28°C共培养60h，然后将玻璃纸反铺到含有潮霉素(100 μ g / mL转化选择抗生素)、头孢菌素(500 μ g / mL,抑制农杆菌生长抗生素)的PDA培养基上28°C培养2天，揭下玻璃纸，在28°C条件下培养I~3天，将抗潮霉素的转化子挑出接种到二筛培养基上，如稳定传代，即是所述扩展青霉基因工程菌。
[0083]实施例3、利用扩展青霉表达设备生产GUS蛋白
[0084]将实施例2中获得扩展青霉基因工程菌和野生型扩展青霉菌分别接种到GM培养基中，在220rpm、26°C震荡培养2天，然后过滤回收菌丝体。菌丝体经蒸馏水洗三遍，然后分别自放入一个印pendorf管中，加入⑶S染液，37°C孵育3~5h，观察菌丝体的染色情况。请参见图4，图4显示转入了 pCHAMBIA2300: =Plip-GUS-Ttrpc的扩展青霉基因工程菌呈现显著的蓝色(图4中的I1、II1、IV)，而野生型的扩展青霉菌株却并未染上颜色(图4中的I)。结果表明，在使用了本发明所述的表达设备后，外源蛋白基因GUS在扩展青霉细胞内得以高效表达。
[0085]实施例4、探究GUS蛋白表汰的精细调控
[0086]4.1⑶S蛋白表达的抑制[0087]将实施例2中获得的扩展青霉基因工程菌(同一株)分别接种到GM培养基和添加了 2%葡萄糖的GM培养基，在220rpm、26°C震荡培养2天，然后过滤回收菌丝体。菌丝体经蒸馏水洗三遍，然后分别放入一个印pendorf管中，加入⑶S染液，370C孵育3_5h，观察菌丝体的染色情况。请参见图5A，图5A显示在添加了 2%葡萄糖的GM培养基中培养后的扩展青霉基因工程菌几乎不能被染上蓝色(图5A中的IV、V、VI);而没有添加葡萄糖的GM培养基中的扩展青霉基因工程菌则呈现很深的蓝色(图5A中的1、I1、III)。结果表明葡萄糖是启动子(Plip)的抑制因子，它能减弱、甚至抑制异源基因在扩展青霉基因工程菌中的表达。
[0088]4.2GUS蛋白的增强表达
[0089]将实施例2中获得的扩展青霉基因工程菌(同一株)分别接种到察氏培养基和添加了 1%橄榄油的察氏培养基中，在220rpm、26°C震荡培养2天，然后过滤回收菌丝体。菌丝体经蒸馏水洗三遍，然后分别放入一个印pendorf管中，加入⑶S染液，370C孵育3_5h，观察菌丝体的染色情况。请参见图5B，图5B显示扩展青霉基因工程菌均有被染上蓝色，但是在添加了 1%橄榄油的培养基中培养后的扩展青霉基因工程菌呈现更深的蓝色(图5B中的a、b、c);没有添加橄榄油培养的扩展青霉基因工程菌则呈现很浅的蓝色(图5B中的d、e、f)。结果表明橄榄油是启动子(Plip)的正调控因子，它能促进异源基因在扩展青霉基因工程菌中的表达。
[0090]本实施例的实验重复进行三次，都得到同样的结果。
[0091]以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质 内容。
【权利要求】
1.一种在扩展青霉细胞内表达外源蛋白的表达设备，其特征在于，所述表达设备从5’至3’依次包括以下元件:(a)控制外源基因在扩展青霉中转录的扩展青霉脂肪酶基因启动
多克隆位点；(C)控制外源基因在扩展青霉中终止转录的构巢曲霉色氨酸合成酶终止子Ttrpco
2.如权利要求1所述的表达设备，其特征在于，所述扩展青霉脂肪酶基因启动子Plip的序列如SEQ ID NO:7所示；所述构巢曲霉色氨酸合成酶终止子Itepc的序列如SEQ ID NO:9所示。
3.如权利要求1所述的表达设备，其特征在于，所述多克隆位点的序列如SEQID NO:8所示。
4.如权利要求1所述的表达设备，其特征在于，所述表达设备还包括以下元件:(d)筛选标记基因的表达盒。
5.如权利要求1~4中任一项所述的表达设备，其特征在于，所述表达设备还包括外源蛋白的编码序列，其位于所述多克隆位点之中、之前或者之后。
6.一种含有如权利要求1~5中任一项所述表达设备的载体。
7.一种含有如权利要求6所述载体的转化子。
8.—种表达外源蛋白的扩展青霉基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的基因组中含有如权利要求5所述的表达设备。
9.一种如权利要求8所述的表达外源蛋白的扩展青霉基因工程菌的制备方法，其特征在于，将含有如权利要求6所述表达设备的根癌农杆菌二元载体转化根癌农杆菌，将所得的根癌农杆菌转化子和扩展青霉结合，挑选基因组中整合有外源蛋白基因表达设备的结合子，即为表达外源蛋白的扩展青霉基因工程菌。
10.一种生产蛋白的方法，其特征在于，包括培养如权利要求8所述的表达外源蛋白的扩展青霉基因工程菌，从培养体系中获得外源蛋白。
11.一种如权利要求8所述的表达外源蛋白的扩展青霉基因工程菌在制备工业酶制剂、饲料添加剂或蛋白质药物中的用途。
【文档编号】C12N1/21GK103757047SQ201410005273
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月6日 优先权日:2014年1月6日
【发明者】唐克轩, 张田 申请人:上海交通大学