专利名称：一株嗜松青霉及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用纤维素生物质产酶及菌体蛋白的的方法。具体涉及利用嗜松青霉菌iPenicilliwn pinophilum)转化纤维素生物质高温热解产物内醚糖或热解液产纤维素酶和菌丝体。
背景技术：
纤维素类生物质是地球上最具开发潜力的重要资源之一。随着人口的增长和化石资源的减少，开发高效转化木质纤维素类等可再生资源的方法日益重要。对纤维素类生物质的有效利用对缓解能源危机、环境问题等有着重要的意义。
纤维素类生物质主要指树木、竹类、农作物稻杆等(Mckendry P. Energy production from biomass (part I) : overview of biomass[J] . Bioresource Technology，2002, 83 :37_46)。研究表明，通过控制热解条件，可以快速有效地将纤维素类物质转化成含有高浓度内醚糖(1，6-脱水-β-D-吡喃葡萄糖)的热解液。
纤维素热解主要产物内醚糖及热解液本身的生物利用是人们近期关注的焦点之一。Nakagawa用内醚糖作为唯一的碳源进行了微生物的同化测试，仅发现曲霉属 Aspergillus (I株)，假丝酵母属Cryptococcus (I株),毕赤酵母属Pichia (I株)，掷孢酵母属株)菌能够利用内醚糖。其中土曲霉如/76 /沿77^/5· terreus利用内醚糖转化为衣康酸(Nakagawa M, Sakai Y, Yasui T. Itaconic acid fermentation of levoglucosan. Journal of Fermentation Technology, 1984, 62: 201-203)。
黑曲霉和土曲霉对脱水内醚糖的同化作用在后来的研究中也有所发现经过诱变的菌株45/76 /沿77" niger CBX-209可转化内醚糖为朽1檬酸(转化率87. 5%) (Zhuang XL , Zhang HX, Yang J Z et al. preparation of Levoglucosan by pyrolysis of cellulose and its citric acid fermentation[J]. Bioresource Technology, 2001,79:63-66)。余志晟以脱水内醚糖为唯一碳源对中国三大菌库(CGMCC，ACCC, CICC)的89 种菌进行了同化测试，发现了七株对内醚糖有同化能力的菌株分别是掷孢酵母属 {Sporobolomyces) I 株，红酵母属 iRhodotorula') I 株,根霉属{Rhizopus') I 株，红曲霉属 (.Monascus) I株。他的后续工作对自然界319份土样进行了同化内醚糖微生物的筛选,结果表明在77份土样中可观察到有明显的微生物生长。其中菌株对内醚糖的利用率为64. 12% (余志晟，纤维素热解产物内醚糖的微生物同化与乙醇发酵测试 [J].中国农学通报，2011，27(6) : 342-349)。目前，嗜松青霉对内醚糖或热解液的转化利用还未见报道。
本发明以内醚糖或纤维素热解液为碳源，经培养可得到大量的嗜松青霉菌体和发酵液。其菌株在南方红豆杉的根际也具有高效解磷的作用，从而促进南方红豆杉的生长(任嘉红，茹文明，张建国等.一种南方红豆杉根际高效解磷嗜松青霉及其应用.[P]，中国专利，CN102229891, 2011)。其液体发酵代谢物对植物寄生虫，特别是对根结线虫具有毒力高、杀线虫效果明显的突出特点(段玉玺，马希斌，陈立杰.一种具杀线虫活力的青霉属真菌及其制备方法和利用[P]，中国专利，CN1944628A，2007)。因此嗜松青霉是一种应用潜力很大的微生物。
以纤维素热解得到的内醚糖或热解液为碳源培养嗜松青霉，可使热解液及内醚糖得到有效的利用，变废为宝，为充分利用生物质资源提供有效的新途径。发明内容
本发明旨在提供一株对纤维素生物质的热解主要产物一内醚糖和热解液能有效利用的嗜松青霉菌株iPenicillium pinophilum),以得到包括菌丝体在内的发酵液和含纤维素酶的酶液。
本发明所述株嗜松青霉^Penicillium pinophilum) ZS2,保藏号为CGMCC NO. 6366。
本发明还公开了嗜松青霉CGMCC NO. 6366在制备纤维素酶中的应用。
利用嗜松青霉CGMCC NO. 6366制备纤维素酶的方法，是将嗜松青霉CGMCC NO. 6366 接种到产酶培养基中培养I 一 5天，得到含纤维素酶的发酵液；所说的产酶培养基配方为(W/W) 2%内醚糖、1%蛋白胨、O. 3%MgS04、0. 5% KH2PO4,O.5%Κ2ΗΡ04、ρΗ3· 0-7. O ；或者是4% 纤维素热解液、1% 蛋白胨、O. 3%MgS04、0. 5% KH2PO4,0. 5%Κ2ΗΡ04、ρΗ3· 0-7. O。
菌体的筛选过程自南京师范大学校内有机质丰富的地方取土样，将土样用无菌水做成菌悬液，取上清液于固体平板上涂布(含1%内醚糖、2%琼脂)，长出菌体后，对菌体单独划线分离纯化，最后将纯化好的菌体接入含不同浓度内醚糖的液体培养基中培养，取样 HPLC检测。经检测其中菌株ZS2具有同化内醚糖的能力。并且在内醚糖浓度为2% (W/W) 时利用率最高。该菌在4%纤维素热解液培养基中利用率也较高。
菌体生长特点嗜松青霉菌在30°C培养时先长出白色丝状菌落，然后逐渐变成黄绿色，最后在菌落中间部位长出绿色或暗绿色的孢子。分生孢子为球形或卵圆形。结合形态分析和18SrDNA序列测定及进化树构建，鉴定该菌为嗜松青霉菌株 pinophilum)。
2012年7月16日将菌株ZS2提交到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏号为CGMCC NO. 6366 ;分类命名为鴻松着霉Penicillium pinophilum ;保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
嗜松青霉菌的酶活力测定采用DNS方法200ul O. 2%的七叶苷加入500ul的酶液，50°C水浴30min，加入Iml DNS，沸水浴5min，定容至10ml，540nm测定吸光值，计算酶活力单位。
本发明中所提到的热解液是由本实验室制得，具体是将秸杆、竹子、木材等农业废料在100°C的条件下烘干并粉碎，利用管式炉热解反应器(主要由管式炉热解器、电加热器、 温控仪、冷凝和真空系统组成)在高温条件下进行热解，收集冷凝得到的组分即为热解液。
图I 2%内醚糖发酵液发酵前的HPLC分析。
图2 2%内醚糖发酵液发酵后的HPLC分析(120h)。
图34%纤维素热解液发酵前的HPLC图。
图44%纤维素热解液发酵后的HPLC图(120h)。
图5嗜松青霉在以2%内醚糖为碳源的发酵液中的生物量变化。
图6嗜松青霉在以2%内醚糖为碳源的发酵液中的生物量变化。
图7嗜松青霉转化内醚糖产葡萄糖苷酶的进程。
图8嗜松青霉转化纤维素热解液产β_葡萄糖苷酶的进程。
具体实施方式
本发明结合具体的实验和数据为本发明作进一步说明，举例是为了说明本发明的过程，而非仅限于实施例。以下实施例所说的菌体或菌液均指嗜松青霉QPeniCiIlium pinophilum)。实施例中纤维素酶活力测定以葡萄糖苷酶为例。
实施例I :配制O. 2%内醚糖(W/W)的发酵液培养基，配方中的其他成份为1%蛋白胨、O. 1%ΚΗ2Ρ04、O.04%MgS04、0. 01%FeS04, pH5. 0.接入 10% 体积的菌液，于 30°C、180rpm 动态培养 3 天，经 HPLC检测，内醚糖利用率为98%。
实施例2 配制20%内醚糖(W/W)的发酵液培养基，配方中的其他成分同实施例1，接入10%体积的菌液，300C、180rpm动态培养6天，经HPLC检测，内醚糖的利用率为83%。
实施例3 配制2%内醚糖(W/W)的发酵液培养基，配方中的其他成分同实施例1，接入10%体积的菌液，300C、180rpm动态培养5天，HPLC检测内醚糖的利用率为100%，内醚糖的利用率见图 I和图2，嗜松青霉的生物量变化见图5。
实施例4 发酵液配方同实施例3，从固体斜面接入菌体，30°C、180rpm动态培养5天，HPLC检测内醚糖的利用率为82%。
实施例5 发酵液配方同实施例3，但培养基pH为3. 0，接入10%的菌液，30 0C、180rpm动态培养5 天，HPLC检测内醚糖的利用率为81%。
实施例6:发酵液配方同实施例3，但调pH为7. 0，内醚糖为发酵底物的发酵液培养基，具体的同实施例3，接入10%的菌液，300C、180rpm动态培养5天，HPLC检测内醚糖的利用率为87%。
实施例7 实施例I中的O. 2%内醚糖换成O. 5%热解液(5%活性炭脱毒)，HPLC检测热解液中内醚糖的利用率为82%。
实施例8:实施例2中的20%内醚糖换成10%热解液(5%活性炭脱毒)，HPLC检测，热解液中内醚糖的利用率为70%。
实施例9:实施例3中的2%内醚糖换成4%热解液(5%活性炭脱毒)，HPLC检测热解液中内醚糖的利用率为90%.热解液中内醚糖的利用率见图3和图4，菌体生物量变化见图6。
实施例10 配制2%内醚糖(W/W)的产酶 培养基，配方中的其他成份为为1%蛋白胨，O. 3%酵母粉，O.3% 无水 MgS04,0. 5% KH2P04,0. 5%K2HP04, pH 为 5. 0.接入10%的菌液30°C、180rpm动态培养5天后,8000rpm离心15min,收集上清液,DNS法测定酶液活力，具体方法为200ul O. 2%的七叶苷加入500ul的酶液，50°C温浴30min后， 加入Iml 了 DNS,沸水浴5min,定容至10ml, 540nm测定,酶活力为341. 5U/ml. ( β -葡萄糖苷酶活力变化见图7)。
实施例11 产酶培养基配制方法同实施例10，DNS法测定酶活力，具体方法为200ul O. 2%的七叶苷加入500ul的酶液30°C温浴30min后，加入Iml 了 DNS，沸水浴5min，定容至10ml，540nm 下测定，算酶活力为127.3 U/ml。
实施例12 产酶培养基配制方法同实施例10，DNS法测定酶活力，具体方法为200ul O. 2%的七叶苷加入500ul的酶液70°C温浴30min后，加入Iml 了 DNS，沸水浴5min，定容至10ml，540nm 下测定，酶活力为94. 2 U/ml。
实施例13 产酶培养基配制方法同实施例10，DNS法测定酶活力，具体方法为200ul O. 2%的七叶苷加入500ul的酶液50°C温浴20min后，加入Iml 了 DNS，沸水浴5min，定容至10ml，540nm 下测定，酶活力为306.7 U/ml。
实施例14 产酶培养基配制方法同实施例10，DNS法测定酶活力，具体方法为200ul O. 2%的七叶苷加入500ul的酶液50°C温浴40min后，加入Iml 了 DNS，沸水浴5min，定容至10ml，540nm 下测定，酶活力为332.6U/ml。
实施例15 将实施例10中的2%内醚糖换成4%热解液(5%活性炭脱毒)，测定酶活力为558. 9U/ ml. ( β-葡萄糖苷酶活力变化见图8)。
权利要求
1.一株嗜松青霉/7i/7o/ Ai7tt ) ZS2,保藏号为 CGMCC NO. 6366。
2.嗜松青霉CGMCCNO. 6366在利用热解液或内醚糖制备纤维素酶中的应用。
3.一种用嗜松青霉CGMCC NO. 6366制备纤维素酶的方法，其特征在于将嗜松青霉 CGMCC NO. 6366接种到产酶培养基中培养I 一 5天，得到含纤维素酶的发酵液；所说的产酶培养基配方为(W/W) 2%内醚糖、1%蛋白胨、O. 3%MgS04、0. 5% KH2PO4,O.5%Κ2ΗΡ04、ρΗ3· 0-7. O ；或者是4% 纤维素热解液、1% 蛋白胨、O. 3%MgS04、0. 5% KH2PO4,0. 5%Κ2ΗΡ04、ρΗ3· 0-7. O。
全文摘要
本发明涉及一种嗜松青霉(Penicilliumpinophilum)菌株对纤维素生物质高温热解液和内醚糖的利用。所述嗜松青霉菌保藏号为CGMCC NO.6366；可利用内醚糖和热解液生长得到嗜松青霉菌丝体并产纤维素酶，是对纤维素生物质的有效利用。
文档编号C12N9/42GK102925370SQ201210467779
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者陈育如, 孙欢, 赵乙萱, 刘军利, 卫民 申请人:南京师范大学