源于板栗坚果的微生物及其应用和微生物菌剂的制备方法
【专利摘要】本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及源于板栗坚果的微生物及其应用和微生物菌剂的制备方法。其中，源于板栗坚果的微生物，2013年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC?M2013568，保藏名称为解淀粉芽孢杆菌亚种CMN1308。该微生物为板栗的一种内生菌，其在抑制由栗疫菌、腐皮镰刀菌、黑葡萄穗霉、扩展青霉和炭疽菌中的至少一种真菌引起的板栗实腐病的防治，以及作为饲料添加剂，促进动物生长提高免疫能力等方面具有良好的作用。与现有技术中用化学农药防治实腐病相比，不会造成对人类健康的危害，以及对环境的污染等问题，具有重要的环保意义。
【专利说明】源于板栗坚果的微生物及其应用和微生物菌剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及源于板栗坚果的微生物及其应用和微生物菌剂的制备方法。
【背景技术】
[0002]板栗(Castanea millissima.BL.)属山毛榉科栗属植物,素有“千果之王”的美称，是我国的重要经济树种之一。板栗含水率高，贮藏和运输过程中很容易发生变色、变味甚至腐烂，学术上称为“实腐病”。实腐病的发病率很高，一般可达20%~30%，严重者达70%，造成巨大的经济损失，严重制约了板栗产业的发展。
[0003]相关技术中，主要使用化学农药来防治板栗的实腐病。
[0004]但是化学农药在使用过程中，存在对人类健康的危害以及对环境的污染等问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种源于板栗坚果的微生物及其应用和微生物菌剂的制备方法，以解决上述的问题。
[0006]在本发明的实施例中第一方面提供了一种源于板栗坚果的微生物，2013年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2013568，保藏名称为解淀粉芽孢杆菌亚种CMNl308。
[0007]在本发明的实施例中第二方面提供了上述微生物在抑制引起板栗实腐病的微生物中的应用。
[0008]在本发明的实施例中第三方面提供了上述微生物作为促进家畜生长，提高免疫力的饲料添加剂的应用。
[0009]在本发明的实施例中第四方面提供了利用上述微生物制备发酵液的方法。
[0010]在本发明的实施例中第五方面提供了上述微生物的固态菌剂。
[0011]本发明实施例提供的源于板栗坚果的微生物及其应用和微生物菌剂的制备方法，其通过筛选获得的微生物:2013年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2013568，保藏名称为解淀粉芽孢杆菌亚种CMN1308，为板栗的一种内生菌，其在抑制由栗疫菌、腐皮镰刀菌、黑葡萄穗霉、扩展青霉和炭疽菌中的至少一种真菌引起的板栗实腐病的防治，以及作为饲料添加剂，促进动物生长提高免疫能力等方面具有良好的作用。与现有技术中用化学农药防治实腐病相比，本发明实施例提供的微生物在防治实腐病时，不会造成对人类健康的危害，以及对环境的污染等问题，具有重要的环保意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1示出了本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌革兰氏染色的显微观察结果；
[0013]图2示出了本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌与相关种的16S rDNA序列系统发育分析示意图；[0014]图3示出了本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌对引起实腐病的真菌的抑菌效果示意图。
【具体实施方式】
[0015]下面通过具体的实施例并结合附图对本发明做进一步的详细描述。
[0016]板栗实腐病主要是由一些致病真菌引起的，其中常见的有:匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)、腐皮键刀菌(Fusarium solani)、黑葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)、栗疫菌(Cryphonectria parasitica)、可可毛色二抱菌(Lasiodiplodia theobromae)、扩展青霉(Penicillium expansum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)、浅黄隐球酵母(Cryptococcus luteolus)、白假丝酵母(Candida albicans)等。
[0017]本发明实施例为了解决在防治板栗实腐病中尽量少用化学农药，以避免化学农药的使用带来的对人类的危害以及对环境的污染等问题，从板栗中筛选内生菌。内生菌(endophyte)是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物。内生菌生活在植物组织中，长期以来与宿主形成密切关系，两者之间互相进行物质、能量及遗传信息交流，在长期协同进化过程中，彼此构成了稳定的生态关系。部分内生菌能够抑制引起实腐病的致病真菌，提高宿主植物的抗病能力，其提高植物抗病性的机制主要包括:(I)产生拮抗微生物的低分子量的化学物质，如:植物保护素、多聚物、木质素、富含经葡氨酸的糖蛋白；(2)诱导一些氧化酶类和水解酶类，如几丁质酶、葡聚糖酶和过氧化物酶；(3)诱导病程相关蛋白的产生。
[0018]因此，经过分离筛选获得能够抑制引起实腐病的致病真菌的内生菌，对防治板栗实腐病、减少化学农药的使用具有重要的意义。
[0019]本发明实施例获得了·一种源于板栗坚果的微生物，并将该微生物(以下简称“本微生物”)进行保藏，保藏号为CCTCC M2013568 ;保藏名称为:解淀粉芽孢杆菌亚种CMN1308(Bacillus amy1liquefaciens subsp.Plantarum CMN1308);保藏单位为:中国典型培养物保藏中心；保藏日期为:2013年11月12日；保藏地址为:中国，武汉，武汉大学。
[0020]本发明实施例优选采用一级母液、二级母液和发酵的三级发酵方式制备本微生物的发酵液，通过优化二级母液和发酵培养基配方和培养条件，使得到的发酵液的活菌含量达到了 10~30X 108cfu/mL。其活菌量高，在用于防治板栗实腐病和作为饲料添加剂时的活性更高，效果更好。
[0021]其中,优选二级母液的培养基配方为:鹿糖25g/L、葡萄糖25g/L、酵母粉15g/L、蛋白粉10g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸锰0.05g/L ;优选的二级母液的培养条件为:将一级母液接入二级母液的培养基中，其中，接种量为I~5% (V/V)，培养条件为:通气比1:1，搅拌转速为150~200r/min，培养温度为35~37°C，罐压为0.01MPa,培养时间为20~22h ;制得所述微生物的二级母液。
[0022]优选发酵培养基配方为:淀粉50g/L、葡萄糖50g/L、酵母粉20g/L、蛋白粉10g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸锰0.05g/L ;优化的培养条件为:将二级母液接入发酵培养基中，接种量为I~5% (V/V)，培养条件为:通气比为1:1，搅拌转速为150~200r/min，培养温度35~37°C，罐压0.01MPa，培养时间为46~48h，制得所述微生物的发酵液。[0023]此外，本发明实施例提供的本微生物的发酵液的制备方法，优选在制备一级母液之前，对保藏的本微生物进行活化的步骤。经过活化的微生物，与保藏中的微生物相比，具有更高的代谢活性，用其制备一级母液时，其活性更高，在制备一级母液的培养基中适应能力更强，繁殖速度更快。有利于一级母液的制备。
[0024]本发明实施例提供的本微生物的固态菌剂，优选采用玉米淀粉为载体。如本领域技术人员可以想到的，制备固态菌剂用的可接受的载体有多种，如玉米淀粉，马铃薯淀粉，土豆淀粉等；其中，玉米淀粉来源丰富且价格低廉，有利于降低固体菌剂的成本。
[0025]本发明实施例中，微生物的干菌粉的制备方法优选为:将微生物的菌悬液离心收集菌泥，再冷冻干燥制成干菌粉。其中，通过冷冻干燥的方法制备干菌粉，由于通过升华的方法，使细胞中的水分直接去除，不会破坏细胞中的蛋白质和核酸等物质，因此可以避免微生物细胞的死亡，导致干菌粉中的活菌数的下降，进而降低固态菌剂的微生物活性。
[0026]本发明实施例中，本微生物的菌悬液的培养条件为:在LB液体培养基中，37°C培养16~20小时，培养基成本低，原料丰富易得，培养温度适中，且培养时间短，而且，得到的菌悬液的活菌数高，达到了 108cfu/g，则用其制备成固态菌剂时，固态菌剂中的活菌数能够达到 108cfu/go
[0027]本发明实施例中，优选将活菌数为108cfu/g微生物的干菌粉和载体按重量比为I: 4进行混合，得到微生物的固态菌剂。
[0028]由于载体和干菌粉的重量比例适当，且干菌粉中的活菌数高，则将上述固态菌剂用于防治板栗实腐病和作为饲料添加剂时的活性更高，效果更好。
[0029]如本领域技术人员可以想到的，本发明实施例中，本微生物作为家畜饲料添加剂的应用中，家畜包括鸡、鸭、鹅、猪等。
[0030]实施例一，本微生物的筛选
[0031]本发明实施例提供的微生物通过以下方法进行筛选获得:
[0032]从湖北省黄R市罗田县胜利镇玫瑰红板栗园中采集板栗坚果，进行常温气调贮藏。取未发生明显板栗实腐病的坚果种皮和内部种仁，按照本领域的常用方法进行内生细菌的分离和培养，得到5种内生细菌，分别编号为CMN1301，CMNl302，CMNl304，CMNl305,CMN1308。分别以引起板栗贮藏期发生实腐病的致病菌:栗疫菌、腐皮镰刀菌、黑葡萄穗霉、扩展青霉、炭疽菌作为指示菌株，按照本领域的常用方法，采取平板对峙培养法和抑菌圈法筛选抑菌能力强的内生细菌。筛选结果如表1所示。
[0033]表1.板栗栗仁内生菌株对病原菌的抑制效果
[0034]
【权利要求】
1.一种源于板栗坚果的微生物，其特征在于，2013年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2013568，保藏名称为解淀粉芽孢杆菌亚种CMN1308。
2.权利要求1所述的微生物在抑制引起板栗实腐病的微生物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引起板栗实腐病的微生物包括栗疫菌、腐皮镰刀菌、黑葡萄穗霉、扩展青霉和炭疽菌中的至少一种。
4.权利要求1所述的微生物作为促进家畜生长，提高免疫力的饲料添加剂的应用。
5.利用权利要求1所述的微生物制备发酵液的方法，其特征在于，包括: 制备一级母液:挑取所述微生物接种于液体培养基中，在37°C，100~120r/min的条件下培养22~24h，制得所述微生物的一级母液； 制备二级母液:将上述一级母液接入二级母液的培养基中，其中，接种量为I~5% (V/V)，培养条件为:通气比1:1，搅拌转速为150~200r/min，培养温度为35~37°C，罐压为0.01MPa，培养时间为20~22h ;制得所述微生物的二级母液； 制备发酵液:将上述二级母液接入发酵培养基中，接种量为I~5%(V/V)，培养条件为:通气比为1:1，搅拌转速为150~200r/min，培养温度35~37°C，罐压0.01MPa，培养时间为46~48h，制得所述微生物的发酵液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于， 所述一级母液的培养基为LB液体培养基； 和/或` 所述二级母液的培养基配方为:鹿糖25g/L、葡萄糖25g/L、酵母粉15g/L、蛋白粉IOg/L、磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸锰0.05g/L ； 和/或 所述发酵培养基配方为:淀粉50g/L、葡萄糖50g/L、酵母粉20g/L、蛋白粉10g/L、磷酸二氢钾 0.5g/L、硫酸锰 0.05g/L。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述制备一级母液的步骤之前还包括活化的步骤。
8.权利要求1所述的微生物的固态菌剂，其特征在于，包括所述微生物的干菌粉和固态菌剂中可接受的载体，所述微生物的干菌粉和所述载体的重量比为1:4 ;所述微生物的干菌粉的活菌数为108cfu/g。
9.根据权利要求8所述的微生物的固态菌剂，其特征在于，所述载体为玉米淀粉。
10.根据权利要求8所述的微生物的固态菌剂，其特征在于，所述微生物的干菌粉的制备方法为:将所述微生物的菌悬液离心收集菌泥，冷冻干燥制成干菌粉。
【文档编号】C12N1/20GK103667142SQ201310672539
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】李琳玲, 程水源, 程华, 华娟, 袁红慧, 张雪花 申请人:黄冈师范学院